基于Toll样受体信号通路研究强精片对小鼠睾丸Sertoli细胞炎性微环境的影响

摘要

目的:　　强精片具有补肾强精、活血化瘀之功，临床用于治疗少弱精子症具有改善肾虚症状，提高精子质量的优势和特色，但其作用机制不清，生物学基础未明。睾丸Sertoli细胞对维持生精微环境起到了至关重要的作用。针对前述关键科学问题，本研究从Sertoli细胞TLR信号通路角度，探索强精片治疗少弱精子症的作用机制，揭示其对Sertoli细胞炎症微环境的作用规律及作用靶点。　　方法:　　本研究分为两部分：　　第一部分：分离和培养小鼠睾丸Sertoli细胞，采用解脲支原体（UU）感染Sertoli细胞，建立UU感染细胞模型，并给予强精片含药血清干预。采用ELISA法检测细胞上清液中IL-1β、TNF-ɑ的含量，探讨强精片含药血清对Sertoli细胞炎性细胞因子分泌的影响，探索其“量-效”关系和“时-效”关系。　　第二部分：分别采用强精片含药血清和TLR4抑制剂TAK242干预UU感染细胞模型，以空白组和感染模型组作为对照。采用RT-qPCR和Western blotting分别检测TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB的基因和蛋白表达水平，免疫荧光技术检测NF-κB的核转位情况，探索强精片含药血清对TLR信号通路的作用靶点，揭示其作用模式和作用规律。　　结果:　　1.UU感染Sertoli细胞后，Sertoli细胞炎性细胞因子IL-1β、TNF-ɑ的分泌量明显增加（P＜0.05）；IL-1β的分泌量于12h达最高峰，达峰后分泌量与时间呈负相关。　　2.强精片含药血清对 Sertoli细胞 IL-1β、TNF-ɑ的分泌具有抑制作用（P＜0.05）。对IL-1β的抑制以5%和10%体积比的含药血清最为明显，对TNF-ɑ的抑制以10%体积比的含药血清最为显著。　　3.强精片含药血清可抑制TLR4 mRNA的表达（P＜0.05），导致TLR4蛋白含量的降低（P＜0.05），且作用优于TLR4抑制剂（P＜0.05）。　　4.强精片含药血清对MyD88 mRNA的表达无明显影响（P＞0.05），但可减少MyD88蛋白的含量（P＜0.05）。　　5.强精片含药血清对TRAF6 mRNA的表达具有一定的抑制作用（P＜0.05），但作用不及TAK242（P＞0.05），但其可降低TRAF6蛋白的含量（P＜0.05），作用强度与TAK242相当（P＜0.05）。　　6.强精片含药血清对NF-κB mRNA的表达无明显的抑制作用（P＞0.05），对NF-κB总蛋白的含量亦无明显影响（P＞0.05），但可抑制 NF-κB的磷酸化水平（P＜0.05），作用强度优于 TAK242（P＜0.05）。同时免疫荧光检测显示，强精片含药血清可明显抑制NF-κB的核转位。　　结论:　　1.强精片对Sertoli细胞相关炎性细胞因子IL-1β、TNF-ɑ的分泌具有抑制作用。　　2.强精片可抑制TLR4、TRAF6基因的表达，减少TLR4、MyD88和TRAF6蛋白的含量，抑制NF-κB的磷酸化和核转位，其对TLR4/MyD88/TRAF6/NF-κB信号通路的干预方式存在多样性。　　3.强精片治疗少弱精子症的作用机理与改善生精微环境的炎症状态密切相关，其可通过调节睾丸Sertoli细胞TLR4/MyD88/TRAF6/NF-κB信号通路降低炎性细胞因子的转录水平，发挥改善炎性微环境作用。

目录

前言

缩略词

引言

第一部分 强精片含药血清对Sertoli细胞炎性因子分泌的影响研究

1.材料

2.方法

3.结果

4.小结

第二部分 强精片含药血清对Sertoli细胞TLR4/MyD88/TRAF6/NF-κB通路的影响研究

1.材料

2.方法

3.结果

4.小结

讨论

1.男性不育症发病率高，已成为全球社会性问题

2.男性不育症发病原因复杂，发病机制不明

3.睾丸Sertoli细胞与少弱精症密切相关

4.西医治疗不育症方法较为局限，疗效并不乐观

5.传统中医理论对男性不育症的认识

6.中医治疗不育症的治则与常用治法分析

7.研究团队遵循传统中医理论指导，充分借鉴前人研究成果，组方创制了“强精片”，其临床疗效确切，作用优势明显

8.针对强精片治疗不育症的作用机理问题，研究团队开展了大量前期研究工作

9.最新研究进展发现，TLRs 信号通路在生精微环境炎症调控中发挥了关键作用，为深入探索强精片治疗不育症的作用机制提供了新切入点

10. UU感染是引起男性不育的重要因素，中医药在生精微环境炎症调控中发挥了重要作用

11.强精片对睾丸Sertoli细胞TLR4/MyD88/TRAF6/NF-κB通路的作用分析

12.强精片对睾丸 Sertoli 细胞分泌炎症相关细胞因子 IL-1β 和TNF-ɑ的作用分析

结论

致谢

参考文献

附件一

综述一:睾丸支持细胞的研究进展

综述二:Toll 样受体（TLRs）信号通路与天然免疫的研究进展

在读期间公开发表的学术论文?专著及科研成果

声明