毛细管电泳免疫-激光诱导荧光检测技术测定氨甲蝶呤对映体耐药A549细胞株中叶酰聚谷氨酸合成酶

摘要

背景：氨甲蝶呤(Methotrexate,MTX)是许多叶酸途径抗肿瘤药物的前体，存在L-(+)-MTX和D-(-)-MTX 2种形式的对映体，广泛应用于淋巴瘤、急性白血病和肺癌等多种肿瘤的治疗，作为MTX代谢途径中的关键酶之一的细胞内叶酰聚谷氨酸合成酶(folylpolyglutamate synthetase，FPGS)，其含量和活性直接与MTX作用效果相关，已成为当今研究的热点，但有关FPGS定量检测的报道甚少。 目的：建立一种FPGS定量检测方法，优化该方法实验条件，对该方法的特异性，分离度及灵敏度等进行方法学评价，并对其检测结果进行统计分析。用该方法检测不同氨甲蝶呤(MTX)对映体作用肺癌A549细胞株前后细胞株内FPGS表达含量，观察FPGS含量变化，为深入探讨肿瘤耐药机制提供新的研究平台。　　方法：首先利用大剂量浓度递增冲击法诱导耐药的方法分别诱导建立25μmol/LL-(+)-MTX耐药细胞株和25 μmol/LD-(-)-MTX耐药细胞株，以敏感细胞株作为细胞内FPGS表达含量的对照；对湿重均约为100mg的敏感细胞株、25μmol/L/LL-(+)-MTX耐药细胞株和25μmol/L D-(-)-MTX耐药细胞株的三组细胞株采用液氮中反复冻融的方法，完全破坏细胞，获取细胞蛋白上清提取液；提取液经经过SDS-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹(Western blot)分析；细胞提取液在室温暗室里与经过透析标记法，采用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocynate，FITC)衍生标记的FPGS抗体反应30 min，使标记抗体与FPGS发生特异性非竞争性免疫反应；反应后立即采取毛细管胶束电动色谱(micellar electrokinetie capillary chromatography,MECC)法结合激光诱导荧光(1aser-induced fluorescence，LIF)检测技术的毛细管电泳免疫.激光诱导荧光检测技术(immunity analysis 0f capillaryelectrophoresis-1aser-induced fluorescence，CEIA-LIF)分离检测FITC衍生标记FPGS以及FPGS抗原抗体复合物，检测MTX不同对映体作用肺癌A549细胞株中FPGS表达含量的。 结果：经SDS-PAGE确认FPGS分子量约为66 000D，WB实验确认FPGS与其特异性抗体没有其他条带出现，并通过凝胶成像系统初步定量：25μmol/L L-(+)-MTX和25μmol/L D-(-)-MTX诱导耐药细中FpFPGS的表达含量分别为敏感细胞的52.14％和60.06％；CEIA-LIF检测方法分离标记FPGS抗体与免疫复合物的时间分别为7.1min、8.9min，且在10min内即完成蛋白的分离和检测，分离度R=4。5；CEIA.LIF检测FPGS的方法在敏感细胞株内检出限为0.6788mg/μl细胞；运用CEIA-LIF检测细胞内FPGS的表达含量的方法，计算得出25μmol/L L-(+)-MTX和25 μmol/L D-(-)-MTX诱导耐药细胞中FPGS的表达含量分别为敏感细胞的46.59％和48.36％，该结果和经典的WB初步定量结果，经SPSS 13.0 Wald模式处理软件分析得知P>0.05，说明两者没有显著差异。 结论：CEIA-LIF检测FPGS方法具有检测速度快，测定时间短的特点。且通过经典的WB法做对照，该方法具有高度的特异性和FPGS定量的准确性。通过该方法中运用了FITC标记技术、MECC分离技术以及LIF检测系统，使检测特异性、敏感度大大的提高。通过建立的CEIA-LIF检测MTX不同对映体作用肺癌A549细胞株中FPGS表达含量，得出L-(+).MTX和D-(-)-MTX诱导耐药后细胞株中FPGS表达含量较敏感细胞株明显减少，说明MTX耐药细胞株FPGS表达含量受损。

目录

论文说明：英文缩略表(abbreviations)

声明

摘要

1前言

2材料和方法

3结果

4讨论

5结论

6研究工作的进一步设想

参考文献

附录 个人简历

致谢

综述（一） 毛细管电泳疫分析技术综述

综述（二）母体外周血及尿液中胎儿核酸检测在产前诊断中的应用