一氧化氮在呼吸道合胞病毒感染人肺上皮细胞中的生成机制及其作用

摘要

目的： 探讨呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)感染人肺上皮细胞A549细胞时，一氧化氮(nitric oxide，NO)的生成变化及其可能的调控机制，研究NO在RSV感染中的作用。 方法： ①RSV感染体外培养的A549细胞，分别于不同感染时间点(4h、8h、16h、24h)收集细胞和细胞培养上清。用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫细胞化学法分别检测细胞中诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)mRNA和蛋白的表达，免疫印迹法检测核内核转录因子KB(nuclearfactor-k-binding，NF-kB)p65蛋白的表达变化，硝酸还原酶法和硫代巴比妥酸法分别检测细胞培养上清NO和自由基氧化损伤产物指标丙二醛(malondialdehyde，MDA)的含量，化学法检测细胞培养上清中活性氧指标羟自由基(hydroxyradical，OH·)与超氧阴离子(superoxide anion，02.-)的水平，空斑形成实验检测细胞培养上清中病毒复制滴度指标空斑形成单位数(plaque forming unit，PFU)；②RSV感染中加入50gmol/L NF-KB特异性抑制剂二硫代氨基吡咯烷(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)抑制NF-1cB的入核活化，用同样的方法检测上述细胞中iNOS的表达；③RSV感染中加入1mmol/L iNOS特异性抑制剂氨基胍(Aminoguanidine，AG)抑制NO的合成，分别检测细胞培养上清中NO、OH.、O2.-、MDA和PFU的变化。 结果： ①RSV感染4h后即上调A549细胞iNOS mRNA转录和蛋白水平的表达。4h后即可诱导核内NF-kBp65蛋白的表达量升高，8h后具有明显升高。细胞培养上清中NO、OH和O2的含量逐渐增加，MDA水平显著增加，病毒复制滴度PFU升高。各指标的变化与正常对照相比差异均有显著性，并且随着RSV感染时间的延长而表达量增加。 ②RSV感染中加入PDTC后，可抑制NF-KB的入核活化，核内NF-KBp65蛋白的表达量明显降低；iNOS mRNA转录和蛋白水平的表达明显下调，在感染4h时即有明显降低，降低具有显著性差异。 ③RSV感染中加入AG后，可抑制iNOS合成NO；降低细胞培养上清中OH和O2.-的含量，O2.-在感染16h后有显著性降低，OH·在感染24h后有显著性降低，MDA含量均有明显下降。但细胞培养上清中的病毒PFU均升高。 结论： RSV感染A549细胞可诱导生成大量的NO，NO的合成主要受iNOS的调节。NF-rB活化对于iNOS基因表达具有重要的调控作用。NO可引起细胞内自由基水平升高，加重细胞的自由基损伤程度，但可降低病毒在感染中的复制滴度。

目录

论文说明：英文缩略词表

声明

1.前言

2.材料与方法

2.1材料

2.1.1病毒

2.1.2细胞

2.1.3试剂

2.1.4仪器及设备

2.2方法

2.2.1溶液的配制

2.2.2病毒增殖及病毒感染单位量测定

2.2.3细胞培养与病毒接种

2.2.4实验分组与标本采集

2.2.5 A549细胞iNOS转录水平的检测

2.2.6 A549细胞iNOS蛋白的免疫细胞化学检测

2.2.7 A549细胞培养上清中NO的检测

2.2.8 A549细胞核内NF-κB p65蛋白的Western blot检测

2.2.9 A549细胞培养上清中OH·的检测

2.2.10 A549细胞培养上清中O2·ˉ的检测

2.2.11 A549细胞培养上清中MDA的检测

2.3统计学处理

3.结果

3.1 RSV增殖结果

3.2 RSV感染A549细胞后iNOS转录水平的变化

3.3 RSV感染A549细胞后iNOS蛋白水平的变化

3.4 RSV感染A549细胞后培养上清中NO的变化

3.5 RSV感染A549细胞后NF-κBp65蛋白表达的变化

3.6 RSV感染A549细胞后培养上清中OH·、O2·-、MDA含量与病毒滴度的变化

3.7 PDTC抑制NF-κB活化后对iNOS表达的影响

3.8 AG抑制iNOS合成NO后细胞培养上清OH·、O2·-、MDA含量与病毒滴度变化

4.讨论

5.结论

参考文献

个人简历

致谢

综述：一氧化氮在抗呼吸道病毒感染中的作用