脾淋巴细胞β肾上腺素受体激活参与佐剂性关节炎大鼠抗体的产生及木瓜苷对其的影响

摘要

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性、炎性、系统性的自身免疫性疾病，病理表现多种多样。在RA的发病过程中不仅有T细胞参与，同时伴有B细胞高度活化，患者血清中可出现多种自身抗体，导致组织和器官的损伤。RA患者体内存在的自身抗体如抗角蛋白抗体(antikeratin antibody AKA)，类风湿因子(rheumatoid factor，RF)等是自身免疫疾病的重要标志。这些特异性抗体与其相应的抗原形成抗原抗体复合物，激活补体系统，触发一系列的自身免疫反应。日益增多的研究表明：自身抗体的产生在RA的病程中发挥着重要的作用。由于RA的病因和发病机制仍不甚明确，目前还没有令人满意的疗法。 木瓜苷(glucosides of chaenomeles speciosa，GCS)是从宣木瓜中提取的有效部位。本课题组前期研究表明，GCS具有较强的抗炎镇痛作用，对大鼠佐剂性关节炎(adjuvant arthrJtis，AA)和胶原性关节炎(collagen-induced arthitis，CLA)均有不同程度的预防和治疗作用。GCS对大鼠关节炎的治疗作用与其调节大鼠滑膜细胞和肠淋巴细胞的鸟苷酸结合蛋白(Guanine nucleotide-binding proteins，简称G蛋白)偶联的信号转导有关。脾脏是机体最大的外周淋巴器官，其中B细胞约占60％。B细胞在抗原刺激下转化为浆细胞，继而分泌特异性免疫球蛋白，同时发挥抗原提呈作用，是体液免疫的基础。β2-肾上腺素受体(β2-adrenergic receptor，β2AR)是一类在免疫应答过程中发挥重要作用的G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors，GPCRs)，其异常表达影响免疫细胞的功能，参与疾病的发生和发展。本研究采用大鼠AA模型，观察GCS对AA大鼠继发侧足爪肿胀度和脾脏病理形态学的影响，首次研究GCS对AA大鼠血清抗体水平的影响及机制；以脾淋巴细胞(spleenlymphocytes，SLC)为实验对象，首次探讨GCS对AA大鼠SLC cAMP水平和β2AR表达的影响，分析SLCβ2AR-G蛋白-cAMP信号转导在GCS下调AA大鼠抗体产生中的作用。 目的： 实验通过观察GCS对AA大鼠足爪肿胀、脾脏病理形态学改变的改善作用，阐述GCS对AA大鼠脾脏功能的影响；通过检测大鼠血清抗体水平SLC cAMP水平和132AR表达情况，阐述SLC β2AR-G蛋白-cAMP信号转导在GCS下调AA大鼠抗体产生中的作用。 方法： 大鼠足趾皮内注射完全弗氏佐剂(Freund'S completed adjuvant，FCA)诱发大鼠AA模型；以GCS(30、60、120 mg·kg-1)治疗给品药(ig，d17-d24)，雷公藤多苷(GTW，40 mg.kg-1)作为阳性对照。足容积法测量继发侧足肿胀、进行多发性关节评分并记录脾脏指数的变化；光学显微镜观察脾脏病理学变化；聚乙二醇(PEG)6000沉淀法检测血清循环免疫复合物(circulating immune complexes，CIC)：酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清中抗Ⅱ型胶原抗体(anti-CIIantibody)水平和抗结核杆菌抗体(anti-TB antibody)水平；放射性免疫法测定脾细胞产生的cAMP水平；免疫组化法动态检测脾脏β2AR蛋白的表达；Western blot法检测β2AR蛋白的表达水平。 结果： 1.GCS缓解AA大鼠关节肿胀和脾脏炎症与其下调血清抗体水平相关GCS(30、60、120mg.kg-1)治疗给药(ig，d17-d24)可不同程度减轻AA大鼠关节肿胀度，改善AA大鼠脾脏炎症和病理变化，其中GCS(120 mg·kg-1，ig，d17一d24)改善最为显著；GCS(60、120 mg·kg-1)可明显降低脾脏指数。 AA大鼠血清循环免疫复合物(circulating immune complexes，CIC)水平、血清中抗Ⅱ型胶原抗体(anti-CⅡ antibody)和抗结核杆菌抗体(anti-TB antibody)水平显著升高，GCS(60、120 mg·kg-l,ig，d17-d24)体内给药可明显降低血清中升高的抗体水平。相关性分析显示，GCS缓解AA大鼠关节肿胀与其降低血清抗体水平密切相关。 2.GCS下调血清抗体水平与其降低SLC胞内升高的cAMP水平相关AA大鼠SLC产生的cAMP水平明显高于正常大鼠，GCS(60、120mg·kg-1)治疗给药(ig，d17一d24)可进一步降低AA大鼠SLc胞内升高的cAMP水平，相关性分析显示，GCS下调血清抗体水平与其降低SLC胞内升高的cAMP水平密切相关，提示GCS调节AA大鼠SLC胞cAMP水平是其下调AA大鼠血清抗体水平，发挥治疗作用的特点之一。 3.AA大鼠SLCβ2AR的表达情况及GCS的调节作用采用免疫组化和Western blot法检测SLC的β2AR蛋白表达水平。AA大鼠致敏后，SLC中β2AR表达水平显著降低，提示SLC β2AR参与AA的发病过程。GCS(60、120mg.kg-1,ig，d17一d24)能明显上调β2AR的表达。这一结果提示GCS通过调节SLC β2AR-G蛋白-cAMP的信号转导通路下调AA大鼠抗体产生。 结论： 1.GCS对AA大鼠关节肿胀和脾脏病理学形态的改变具有明显的改善作用；GCS能显著下调血清抗体水平。 2.降低AA大鼠SLC升高的cAMP水平是GCS下调血清抗体水平的重要特点之一。3.GCS可上调SLC的132AR蛋白表达水平，恢复AA大鼠SLC的β2AR-G蛋白-cAMP信号的正常转导可能是GCS下调抗体水平的部分机制。

目录

论文说明：英文缩略词对照(Abbreviation)

声明

1前言

2实验材料

2.1动物

2.2药物

2.3试剂

2.4仪器与设备

3实验方法

3.1大鼠AA模型的建立与评价

3.2动物分组及给药方案

3.3脾脏指数的检测

3.4血清抗体水平的测定

3.4.1血清循环免疫复合物的测定

3.4.2抗结核杆菌抗体的测定

3.4.3抗CⅡ抗体的测定

3.5脾淋巴细胞cAMP水平的测定

3.6免疫组织化学检测脾脏β2AR蛋白的表达

3.6.1试剂及材料

3.6.2操作流程

3.6.3结果判断

3.7 Western blot法检测SLCβ2AR蛋白的表达

3.7.1蛋白的提取

3.7.2蛋白定量

3.7.3 Western-blot操作步骤

3.8统计学处理

4结果

4.1GCS抑制AA大鼠继发侧关节肿胀和脾脏炎症与其下调血清抗体水平的关系

4.1.1 GCS对AA大鼠继发关节肿胀度的影响

4.1.2 GCS对AA大鼠多发性关节炎指数的影响

4.1.3 GCS对AA大鼠脾脏指数的影响

4.1.4 GCS对AA大鼠脾脏病理的影响

4.1.5 GCS对AA大鼠血清抗体水平的影响与足肿胀的关系

4.2 GCS抑制AA大鼠SLC cAMP水平和下调血清抗体水平之间的关系

4.2.1 GCS对AA大鼠SLC cAMP水平的影响

4.2.2 GCS抑制AA大鼠SLC cAMP水平与其下调血清抗体水平之间的关系

4.3 AA大鼠脾脏β2AR蛋白的免疫组化及GCS的作用

4.4 GCS对AA大鼠SLCβ2AR蛋白表达的影响

5讨论

5.1 GCS抑制AA大鼠继发性关节肿胀度与其下调AA大鼠血清抗体水平有密切的关系

5.2降低AA大鼠SLC胞内升高的cAMP水平是GCS下调血清抗体水平的主要特点之一

5.3恢复AA大鼠SLC β2AR的表达平衡是GCS下调血清抗体水平的重要机制之一

6小结

6.1 GCS缓解AA大鼠关节肿胀和脾脏炎症与其下调血清抗体水平相关

6.2降低SLC胞内升高的cAMP水平是GCS下调血清抗体水平的重要特点之一

6.3 AA大鼠脾脏β2AR的表达情况及GCS的调节作用

7参考文献

附录

致谢

综述 β2肾上腺素受体功能和反应调节的分子机制