利用荧光原位杂交对人类植入前胚胎行性别诊断的研究

摘要

本研究分为三部分： 第一部分： 目的：以昆明(KM)小白鼠体外受精(IVF)胚胎为研究对象，尝试应用激光法活检鼠胚，探讨活检技术对胚胎早期发育的影响。 方法：对促排卵获取的小鼠卵母细胞进行体外受精和培养，然后用激光法活检收集的4细胞和8细胞胚胎，最后观察活检后胚胎的发育情况。 结果： 1.共获卵母细胞360枚，受精率和卵裂率分别为92.0％和94.3％。 2.4-细胞胚胎活检组的囊胚形成率及孵出囊胚率分别为76.6％和65.6％，8-细胞胚胎活检组的囊胚形成率及孵出囊胚率为70.4％和59.3％，分别与未活检对照组相比，差异无显著性(P>0.05)；4-细胞活检组和8-细胞活检组的囊胚形成率及孵出囊胚率间相比较，也无显著性差异(P>0.05)。 结论：:激光法对小鼠4细胞或8细胞胚胎进行单卵裂球活检，不影响胚胎的后期发育，是一项有效的胚胎卵裂球活检方法。 第二部分： 目的：以人类多精受精胚胎单卵裂球为对象，对传统低渗固定法进行改良，探讨一种更简便效率更高的固定方法。 方法：收集30枚人类多精受精胚胎激光打孔后去除透明带，将获得的完整卵裂球按传统低渗固定法和直接固定法进行固定后行X,Y染色体双色荧光原位杂交，比较固定率和杂交率。 结果： 1.固定卵裂球共171枚。低渗固定法(A组)固定80枚，成功68枚，成功率为85.0％。直接固定法(B)组固定91枚，成功82枚，成功率为90.1％。两组有显著性差异。 2.A组杂交率为77.5％(/每卵裂球数)，91.2％(/每核数)，B组杂交率为83.5％(/每卵裂球数)92.7％(/每核数)。两组无显著性差异。 结论：直接固定法简化了固定步骤，降低了细胞丢失率，为较理想的单个卵裂球间期核固定技术。 第三部分： 目的：应用双色荧光原位杂交技术分析植入前胚胎性染色体，为植入前遗传学诊断的临床开展建立性别诊断的技术。 方法：将激光活检法活检出的卵裂球用直接固定法固定，然后应用荧光原位杂交进行性别诊断。FISH步骤包括变性、杂交、洗脱和荧光显微镜观察结果进行分析等。用淋巴细胞作为对照分析。 结果： 1.对40枚人类卵裂期胚胎进行了活检，成功活检36枚，破坏胚胎4枚，活检成功率为90％(36/40)。 2.对90枚卵裂球进行固定，其中83枚被成功固定，固定成功率为92.2％。 3.对固定成功的83枚卵裂球细胞行双色FISH性别鉴定，78枚细胞见到荧光信号，杂交率为94.0％。活检的40枚胚胎中有34枚获得了可分析FISH结果，占活检胚胎的85％(34/40)，占成功活检胚胎的94.4％(34/36)。34枚有FISH结果的人类早期胚胎中，其中10枚为正常女性胚胎，14枚为正常男性胚胎，8枚为性染色体嵌合型胚胎。 4.共计数间期核或中期相细胞核200个，198个细胞核见杂交信号。 结论： 1.激光法可用于人类胚胎活检。 2.荧光原位杂交技术可快速高效，准确地对人类植入前胚胎进行性别诊断，性染色体嵌合型不影响性别诊断的准确性。 3.建立了人类植入前胚胎单卵裂球性别诊断的FISH技术平台。

目录

论文说明：中英文缩略词对照表

声明

前言

第一部分激光法活检对小鼠体外受精胚胎后期发育的影响

1材料与方法

2结果

3讨论

4结论

第二部分单卵裂球固定方法的相关研究

1材料与方法

2结果

3讨论

4结论

第三部分利用FISH技术对人类早期胚胎进行性别检测

1材料与方法

2结果

3讨论

4结论

附图

参考文献

附录 个人简历

致谢

综述 植入前遗传学诊断的相关研究进展