人PTP1B克隆表达及豹皮樟总黄酮治疗2型糖尿病大鼠部分机制的研究

摘要

蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）属于蛋白质酪氨酸磷酸酶（PTPs）家族，以跨膜受体样蛋白和胞内酶2种形式存在，催化蛋白质的磷酸化酪氨酸残基的去磷酸化反应，是哺乳动物体内最早被鉴定、纯化的PTPs[1，2]。PTP1B作用于胰岛素受体(IR)，胰岛素受体底物1、2(IRS-1，IRS-2)，生长因子受体结合蛋白2(Grb2)，磷脂酰肌醇3激酶(PI-3K)等与胰岛素信号转导相关的蛋白，使它们的磷酸化酪氨酸残基脱磷酸，衰减胰岛素信号转导，从而产生受体后的胰岛素抵抗[3]。最近有人向小鼠的肝细胞瘤中导入针对PTP1B的siRNA，结果发现胰岛素信号转导增强[4]，再次证实了PTP1B在胰岛素信号通路中的作用。PTP1B的高表达除了引起胰岛素抵抗外还可引起瘦素抵抗，从而引发2型糖尿病（T2DM）及肥胖[5，6]。PTP1B基因敲除鼠不仅胰岛素敏感性增强，而且去除了PTP1B对胰岛素和瘦素信号转导的抑制，使小鼠在高脂饮食条件下也不发生肥胖，且发育良好，具有正常的繁殖能力，癌症的发生率也未见提高[7]，这提示了PTP1B作为胰岛素信号通路的主要负调控因子，其小分子抑制剂可能是有效的抗糖尿病/肥胖症药物，而且不产生副作用。事实上PTP1B抑制剂已成为胰岛素增敏剂的候选药物之一[8]，全世界有不少实验室正在从天然中草药或人工合成的药物中以PTP1B作为靶点筛选高特异性的抑制剂。PTP1B与肥胖症、T2DM和肿瘤关系密切[7]，因此它的大规模诱导表达对研究这些疾病有着重要的意义。本研究将PTP1B基因作为T2DM合并肥胖症的重要候选基因，结合豹皮樟总黄酮（TFLC）对T2DM大鼠模型的疗效及降糖机制研究，为TFLC应用于临床治疗肥胖合并2型糖尿病提供前期试验依据。主要研究内容包括以下四个方面：
　　 ⑴人PTP1B基因cDNA全长的克隆和原核系统表达。取2型糖尿病人（BMI>28kg·m-2）外周抗凝静脉血，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，提取总RNA，以Oligo dT为引物，合成出cDNA第一链。以逆转录（RT）产物为模板，PCR扩增出PTP1B插入片段，连接入克隆载体pMD-18T Vector中构建pMD-hPTP1B。设计带酶切位点（BamHⅠ，EcoRⅠ）的引物，以pMD-18T Vector作模板进行亚克隆，双酶切后构建原核表达载体pET28a(+)-hPTP1B，氯化钙法转化入BL21（DE3），IPTG诱导表达并对诱导剂的浓度、时间及诱导温度等条件进行了优化。从2型糖尿病患者外周血中扩增得到1301bp PTP1B cDNA全长序列，经双酶切鉴定及测序分析，表明已成功构建了原核表达载体pET28a(+)-hPTP1B；IPTG的最适诱导浓度为0.05mmol·L-1，最适诱导时间为5h，最适诱导温度为37℃；Western blot表明表达的重组融合蛋白具有与天然hPTP1B相同的结合抗体活性。
　　 ⑵rhPTP1B蛋白的分离纯化、酶活性测定以及抑制剂实验。亲和层析法纯化rhPTP1B，复性后用于酶活性测定及抑制剂的实验。取细菌裂解上清液经Ni2+亲和层析柱纯化后，利用PTP1B水解特异性底物4-硝基苯基磷酸二钠盐(pNPP-Na2)的磷酸基团而产生颜色反应来测定rhPTP1B的活性，分析其与rhPTP1B浓度、底物浓度及反应温度的关系，确定钒酸钠（Na3VO4，VAN）的抑制类型和豹皮樟总黄酮(TFLC)对rhPTP1B的抑制作用和浓度依赖关系，并研究2型糖尿病常用治疗药物吡格列酮和二甲双胍对rhPTP1B有无抑制作用，探讨其有无新的降血糖机制。结果表明诱导表达纯化的rhPTP1B融合蛋白可用于抑制剂的研究：1.rhPTP1B活性随酶浓度及底物浓度的增加而增加；2.35℃时rhPTP1B的活性最大；3.VAN的抑制作用呈浓度依赖性增强，可能为非竞争性抑制作用；4.TFLC对rhPTP1B有明显的抑制作用；5.治疗2型糖尿病的常用药物二甲双胍和吡格列酮对PTP1B酶并无明显抑制作用，说明这两种药物不是通过对PTP1B的抑制起作用的。
　　 ⑶人PTP1B基因的真核系统表达及在HepG2细胞的胰岛素信号通路中的作用。构建真核表达载体pcDNA3.1-hPTP1B，电穿孔法转染至人肝癌HepG2细胞，G-418筛选2周后得到稳定转染的细胞株，检测rhPTP1B在转录水平和翻译水平的表达，免疫荧光法确定表达的rhPTP1B主要定位在细胞浆，MTT法初步研究rhPTP1B可能对细胞增殖和细胞周期无显著影响，免疫沉淀法结合Western blot检测其对IRS-1、Irβ的去磷酸化作用，结果表明rhPTP1B可显著减少IRS-1、Irβ的磷酸化程度，即明显衰减胰岛素刺激时胰岛素的信号转导通路；构建了真核沉默载体pBI-dsPTP1B，瞬时转染HepG2细胞，Western blot检测PTP1B的被抑制表达可达约50％。
　　 ⑷新型2型糖尿病大鼠模型的建立、TFLC的治疗及与PTP1B表达的关系。用高糖高脂乳剂灌胃雄性SD大鼠5个月，小剂量STZ注射构建T2DM模型，分别给予 TFLC （400mg/kg）和阳性对照药钒酸钠（VAN，10mg/kg）灌胃治疗6周，观察疗效。结果表明：糖尿病大鼠经TFLC治疗后空腹血糖（FBG）、糖化血红蛋白（HbA1c）、胰岛素（FINS）、游离脂肪酸（FFA）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白（LDL-C）、胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）显著下降，高密度脂蛋白（HDL-C）和胰岛素敏感指数（ISI）明显提高，胰岛β细胞显著增生，肝匀浆丙二醛（MDA）含量下降，超氧化物歧化酶（SOD）活性升高；肾、心肌和肝脏的病理学明显改善。RT-Real time PCR、Western blot 结果表明T2DM组靶组织中PTP1B的表达明显升高，TFLC组中PTP1B的表达明显降低。与VAN相比，TFLC可明显降低血糖和血脂，减轻肝脏组织的自由基氧化应激，其改善胰岛素抵抗，可能与其显著促进胰岛β细胞的增生，明显降低靶组织中PTP1B的表达，增强胰岛素信号通路有关。