鸡MDA5-STING-IFN-β抗病毒天然免疫通路的发现及其信号转导机制

摘要

天然免疫在机体抗病毒感染中发挥十分重要的作用。病毒感染宿主细胞后，宿主细胞通过模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)识别病原相关分子模式(pathogen-assoeiated molecular patterns，PAMP)，进而通过一系列级联免疫反应，诱导干扰素(IFN)和促炎症细胞因子等抗病毒分子产生，发挥抗病毒作用。RIG-I样受体（retinoic acid-inducible gene-I-like receptor，RLR）是一类胞质内的PRR，哺乳动物 RLR包括三个成员：RIG-I、MDA5（mammalian melanoma differentiation associated gene5）和LGP2（laboratory of genetics and physiology2），其中，RIG-I在 RNA病毒识别及抗病毒感染过程中的作用尤为重要。虽然鸭、鹅、鸽子等禽类都具有RIG-I基因，但是鸡细胞中RIG-I基因天然缺失。　　STING（stimulator of interferon genes）是新发现的另一个重要的天然免疫枢纽分子，哺乳动物的STING通过 RIG-I识别 RNA病毒并基于RIG-I-STING-IRF3-IFN-β信号传导轴诱导Ⅰ型干扰素产生。对鸡基因组分析发现，鸡有一个疑似STING（chSTING）基因，那么chSTING能否参与RNA病毒识别和干扰素诱导？虽然哺乳动物STING并未出现在MDA5介导的Ⅰ型干扰素信号通路中，那么在RIG-I天然缺失的鸡细胞中，同为RNA模式识别受体的chMDA5是否会与chSTING建立联系、形成新的信号通路？据此，本文聚焦chSTING基因，研究其在Ⅰ型干扰素诱导及抗RNA病毒中的作用，揭示其发挥功能的分子基础，探究其不同于哺乳动物的Ⅰ型干扰素天然免疫通路及信号传导机制。　　本文首先克隆了可能涉及 chMDA5通路的免疫分子 chMDA5、chMAVS和chIRF7，通过基因过表达和 RNA干扰介导的基因下调实验，发现 chMDA5、chMAVS和 chIRF7均为干扰素诱导相关基因，其在鸡细胞的干扰素诱导和抗H9N2禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）中发挥重要作用，为系统研究chMDA5介导的信号通路及揭示其与chSTNG的关系奠定了基础。　　为了确定chSTING在RIG-I缺失的鸡细胞中的功能，本文克隆了chSTING基因，序列分析发现chSTING与人STING各功能域相似度低，同源性仅为43.3%。组织分布分析发现 chSTING在鸡所有组织器官中均能表达，但在免疫器官中分布最丰富。亚细胞定位显示 chSTING在内质网和线粒体上均有定位，但其在内质网上定位更占优势。通过基因过表达和RNA干扰实验发现，chSTING能够强烈诱导Ⅰ型干扰素产生。同时，抗病毒研究发现chSTING在抗RNA和DNA病毒中均发挥重要作用。表明鸡具有STING基因，并且chSTING参与了Ⅰ型干扰素诱导及抗病毒免疫。　　为了揭示chSTING介导信号传导的分子基础，通过功能域删除和定点突变，进一步研究了chSTING的活性功能域和关键氨基酸位点。功能域删除研究发现，chSTING的4个跨膜区（transmembrane domain，TM）对其功能的发挥十分重要，每个跨膜区的删除都显著降低了 chSTING的干扰素诱导作用，且其 C端的28个氨基酸的删除可导致chSTING功能完全丧失，提示该区域包含chSTING发挥功能至关重要的功能域或氨基酸位点。定点突变研究结果表明，chSTING的信号传导可能涉及蛋白磷酸化和泛素化修饰等调控机制，并发现chSTING的S366位点对其功能极其重要，S366A突变可导致chSTING功能完全丧失。　　虽然在哺乳动物细胞中，STING只参与了RIG-I通路而未出现在MDA5通路中，但是，由于鸡RIG-I天然缺失且本研究发现chSTING具有抗RNA病毒的作用，因此推测chSTING可能与鸡最重要RNA模式识别受体chMDA5具有密切联系。通过研究发现，RNA干扰介导chSTNG表达下调可显著抑制poly（I:C）和chMDA5过表达对IFN-β的激活，提示chSTING可能参与到chMDA5信号通路中。同时，免疫共沉淀（Co-IP）结果显示，chSTING能够与chMDA5发生相互作用，并且chMAVS的存在能够增强chMDA5和chSTING的相互作用，表明chSTING能够参与到chMDA5介导的Ⅰ型干扰素信号通路中。进一步研究发现，chMDA5的CARD区、CARD+DEXD区、chMDA5全长均能与chSTING发生互作并激活 IFN-β通路，缺失了 CARD区的chMDA5虽然能够与 chSTING发生互作，但不能激活 IFN-β通路。表明 chSTING通过与 chMDA5的CARD区互作参与到了chMDA5通路中并激活IFN-β。　　哺乳动物STING通过IRF3激活IFN-β，然而鸡IRF3也天然缺失，为了确定chSTING激活IFN-β所依赖的转录因子，通过软件分析发现鸡IFN-β启动子上有3个IRF顺式作用元件。通过chSTING过表达、chIRF7过表达、chSTNG下调表达对 IRF顺式作用元件报告基因和 IFN-β启动子的激活情况研究，确定chSTING通过chIRF7激活IFN-β。　　为了确定chSTING在chMDA5介导的Ⅰ型干扰素信号通路中的具体位置，本文进一步通过多基因过表达和RNA干扰矩阵实验，并结合蛋白互作结果，确定了一条由chMDA5介导、以chSTING为核心的chMDA5-chMAVS-chSTING-chIRF7-IFN-βⅠ型干扰素信号传导轴。　　综合以上研究结果，本文在RIG-I和 IRF3基因天然缺失的鸡细胞中发现了一条不同于哺乳动物的chMDA5-chMAVS-chSTING-chIRF7-IFN-β天然免疫信号通路，在这条通路中，chSTING通过chMAVS接收chMDA5传递的病原识别信号，进而通过下游的chIRF7激活IFN-β，发挥抗病毒作用。该通路的发现不仅更新了MDA5不能通过STING诱导干扰素的传统理论，更为深入揭示鸡的天然免疫机制、开展抗病毒应用奠定了理论和应用基础。

目录

声明

第一章 文献综述RIG-I样受体介导的Ⅰ型干扰素信号通路研究进展

1. RIG-I样受体的发现

2. RLRs的结构和功能分析

3. RLRs的配体研究

4. RLRs信号传导机制

5．STING在RIG-I信号通路的作用

6．禽类RLRs介导的信号通路研究概况

7．结语

第二章 鸡MDA5信号通路中免疫分子的克隆与功能研究

摘要

1 前言

2 材料与方法

3 结果

4. 讨论

第三章 鸡STING诱导Ⅰ型干扰素及抗病毒作用研究

摘要

1. 前言

2．材料与方法

3. 结果

4. 讨论

第四章 鸡MDA5-STING-IFN-β信号通路的发现

摘要

1．前言

2 材料与方法

3. 结果

4. 讨论

第五章 chSTING信号传导机制初步研究

摘要

1. 前言

2. 材料和方法

3. 结果

4. 讨论

第六章 全文总结

1. 主要结果

2. 研究展望

参考文献

附录一 论文常用缩略词

攻读博士学位期间以第一作者发表的SCI论文

致谢