产质粒介导AmpC酶的肺炎克雷伯菌耐药性及新基因、整合子研究

摘要

目的：
　　 了解安徽省2007年临床分离的180株肺炎克雷伯菌产质粒介导AmpC β-内酰胺酶的情况及产酶菌株的耐药性。
　　 研究产质粒介导AmpC β-内酰胺酶阳性菌株的耐药基因型别的分布。
　　 研究新型质粒介导AmpC酶的分子生物学特性及Ⅰ类整合子的检测定位。
　　 材料和方法：
　　 收集安徽省细菌耐药监控网中的33家医院2007年9月（9月1日到30日）从临床标本（去除同一病例相同部位重复分离的菌株）中分离的肺炎克雷伯菌180株，采用全自动微生物分析仪对标本进行重新鉴定。
　　 经头孢西丁纸片法试验初筛出产AmpC酶菌株，对初筛阳性的细菌，采用三维试验筛选。经质粒提取和多重聚合酶链反应（PCR）扩增携带AmpC酶菌株基因，阳性菌株进一步行全编码引物PCR扩增，将全编码区PCR扩增产物按Sanger双脱氧末端终止法，用自动测序仪对其进行测序以鉴定基因型。对其中测序证实有基因突变的菌株行克隆测序。并用琼脂平板稀释法测定AmpC阳性菌株对17种抗菌药物的耐药性。
　　 将一株携带新酶全编码基因的细菌转移结合到受体菌E.Coli J53中，接合子用含100mg/L的叠氮纳和2mg/L头孢西丁的LB琼脂平板筛选。采用Southern Blotting试验再次验证新酶是否由质粒介导并定位其编码基因所在质粒的大小。
　　 将新酶全编码基因克隆入表达载体pHSG398，转化于感受态细胞E.coli JM109，用加有抗菌药物的琼脂平板进行转化株筛选。用琼脂平皿稀释法对野生株、接合子与转化株同时进行MIC测定。
　　 采用超声破碎法进行产新酶细菌转化株的粗酶提取，粗酶纯化后，等电聚焦电泳测定其pI。SDS-PAGE和考马斯蓝染色测定新酶分子量大小，进行酶促反应动力学研究，以初步了解新酶的动力学特性。
　　 同时对该突变菌株及其结合子行Ⅰ类整合子保守序列的扩增及测序，并采用Southern Blotting试验验证Ⅰ类整合子保守序列是否由质粒介导并定位其编码基因所在质粒的大小。
　　 结果：
　　 180株肺炎克雷伯菌经目的基因测序后确证产AmpC酶的菌株有21株，占11.67％。其中DHA型19株，EBC型4株，有3株检出新基因(GenBank登录号为FJ237366，FJ237367，FJ237368)；药敏结果显示产酶株均为多重耐药，除亚胺培南与美罗培南外，对三、四代头孢菌素，氨基糖苷类及喹诺酮类均有不同程度的耐药性。
　　 突变株K.pneumonia E701经转移接合实验及Southern杂交证实其携带的AmpC酶全编码基因为质粒介导。新型质粒介导AmpC酶的耐药谱未发生显著变化。新酶全编码基因经克隆表达，提酶纯化后，等电点测定为8.4，且酶对头孢西丁有高水解率。这种等电点为8.4的酶的活性不能被β-内酰胺酶抑制剂所抑制。
　　 突变株Ⅰ类整合子保守序列的扩增测序解释了其对氨基糖苷类抗菌药物的耐药性，Southern杂交证实Ⅰ类整合子位于同样大小的质粒上。
　　 结论：
　　 1.安徽地区产AmpC酶的肺炎克雷伯菌以DHA型为主，同时存在EBC型突变株。
　　 2.高产AmpC酶的细菌感染临床上推荐使用碳青霉烯治疗。
　　 3.新型质粒介导AmpC酶中的突变为中性突变，整合子可能是其水平传播的重要机制。