呼吸道合胞病毒治疗性单克隆抗体的制备及其免疫保护作用研究

摘要

目的：人呼吸道合胞病毒（Human Respiratory Syncytial Virus，RSV）广泛分布于世界各地，是导致婴幼儿严重下呼吸道感染最重要的病毒病原。病毒感染机体后的免疫保护机制尚未明确，也无特异性防治方法。本研究尝试利用杂交瘤技术，制备具有中和活性的单克隆抗体，并开展RSV免疫治疗研究，以期为研制具有自主知识产权的RSV治疗性单克隆抗体奠定基础。
　　 方法：用RSV活病毒通过滴鼻免疫小鼠，取免疫小鼠的脾脏与骨髓瘤细胞进行细胞融合，通过有限稀释法亚克隆和间接ELISA进行筛选，获得稳定分泌抗RSV单克隆抗体（Monoclonal antibody，McAb）的杂交瘤细胞株。将杂交瘤细胞注入小鼠腹腔诱生腹水，利用G蛋白亲和层析法从腹水中纯化抗体。使用SDS-PAGE检测纯化后抗体的纯度，间接ELISA、间接免疫荧光（indirect immunoflurescence，IIF）和Western blot方法分析抗体对RSV融合蛋白（fusion protein，F）的特异性结合能力，间接ELISA、非竞争ELISA及竞争ELISA分别测定抗体的亚型、亲和常数和抗原识别表位，为了更好的开展抗体生物活性研究，我们还建立了免疫酶法（immunoenzyne，IE）分析RSV病毒滴度的方法，应用IE法体外蚀斑减少中和实验，确定该株单抗的中和活性，并计算中和效价，通过融合抑制实验确定该株单抗是否具有融合抑制活性。用Trizol法从杂交瘤细胞株中提取总RNA，应用鼠源抗体重链和轻链通用引物，通过PCR扩增抗体的轻链和重链可变区基因，并克隆入pGEM-T载体中，进行核酸序列分析，并与现有的RSV单克隆抗体进行同源性比对。利用RSV感染的动物模型，进一步分析单克隆抗体的体内中和活性。
　　 结果：获得1株稳定分泌抗RSV F蛋白的杂交瘤细胞株F8，纯化后抗体的纯度达到95％以上。该单抗能够识别F蛋白单体，抗体亚型为IgG1，亲和常数（Ka）为6.8×108 L/mol，抗原识别表位位于F蛋白的抗原表位区205-222位氨基酸。该株单抗可以在体外抑制RSV对Hep-2细胞的感染，具有中和活性，同时具有融合抑制活性。扩增出抗体轻链和重链可变区基因，并克隆入pGEM-T载体中。测序结果显示重链可变区基因序列全长371 bp，编码124个氨基酸；轻链可变区基因序列全长323 bp，编码107个氨基酸，在GeneBank对氨基酸序列进行比对分析，两者均符合小鼠IgG可变区基因的特征。与美国专利网上提交的具有中和活性的RSV鼠源单抗的重链轻链同源性分别为95.37％与75.4％。抗体体内保护实验显示，该抗体可降低感染RSV小鼠的肺脏病毒滴度。
　　 结论：制备了能特异性识别RSV F蛋白的单克隆抗体F8，完成了纯化和性质鉴定，扩增出抗体轻链和重链可变区基因，与已知的具有中和活性的RSV单抗的可变区基因有较高的同源性，可以确定所得到的序列为RSV抗体轻链和重链可变区序列，而非其他基因的序列。以IE法为基础的RSV病毒滴度分析方法显示F8在体内体外具有中和活性和融合抑制活性，为RSV感染的免疫治疗和抗体人源化改造奠定了坚实基础。