酸敏感离子通道阻断剂阿米洛利对佐剂性关节炎大鼠关节软骨的保护作用及部分机制研究

摘要

目的：阐明酸敏感离子通道阻断剂阿米洛利（Amiloride）对佐剂性关节炎（adjuvant arthritis，AA）大鼠关节软骨的保护作用；从软骨细胞凋亡的角度，研究Amiloride对AA大鼠关节软骨的保护作用可能的环节；通过检测Amiloride对AA大鼠关节软骨细胞外游离钙离子浓度、钙离子依赖的凋亡相关酶类表达的变化，分析Amiloride抑制AA大鼠关节软骨细胞凋亡可能的作用机制。
　　 方法：将大鼠随机分为正常组、AA模型组、Amiloride（2.5、5.0、10.0 mg·kg-1·d-1）组和阿司匹林（50 mg/kg）对照组。弗氏完全佐剂(CFA)致AA后第10天，大鼠出现继发性炎症，此时Amiloride、阿司匹林灌胃给药，连续8 d；正常组与模型组给予等容量的无菌注射用水。检测大鼠继发侧关节肿胀度变化，光学显微镜观察关节病理变化，免疫组织化学技术测定Amiloride对AA大鼠关节软骨中的Ⅱ型胶原（COII）蛋白合成的影响，Alcian染色测定Amiloride对AA大鼠关节软骨中的蛋白多糖（PG）合成的影响，透射电镜、Tunel法观察Amiloride对AA大鼠关节软骨细胞凋亡的影响。胶原酶-胰蛋白酶消化法分离培养关节软骨细胞，胞外酸化诱导建立AA大鼠关节软骨细胞凋亡体外模型，TUNEL染色及PI单染色法观察AA大鼠关节软骨细胞的凋亡，钙离子成像技术检测[Ca2+]I水平，免疫细胞化学技术检测AA大鼠关节软骨细胞calpain、calcineurin、iNOS的表达。
　　 结果：
　　 1.酸敏感离子通道阻断剂阿米洛利（Amiloride）对AA大鼠关节软骨的保护作用Amiloride各剂量组对AA大鼠炎症继发侧关节足肿胀未见明显影响；病理学观察关节软骨表面光滑，软骨细胞层次尚清晰，成熟软骨细胞数量增加；免疫组化及Alcian染色检测显示关节软骨基质成分COII蛋白和PG的表达量增加。
　　 2.酸敏感离子通道阻断剂阿米洛利（Amiloride）对AA大鼠关节软骨细胞凋亡的影响体内实验透射电镜观察Amiloride各剂量组软骨细胞核内异染色质轻度边集、细胞内粗面内质网轻度扩张、线粒体轻度肿胀，与模型组软骨细胞核膜皱缩、核染色质高度边集、核膜破裂、出现凋亡小体相比无明显细胞凋亡的特征；Tunel法原位检测显示凋亡阳性细胞数显著减少(P<0.01)。体外实验PI染色发现Amiloride各给药组及PcTx1组细胞凋亡率与模型组相比明显降低；Tunel法原位检测显示Amiloride各剂量组及PcTx1组凋亡阳性细胞数减少。
　　 3.酸敏感离子通道阻断剂阿米洛利（Amiloride）对AA大鼠关节软骨细胞游离钙(ionized free calcium，Ca2+)水平及钙离子依赖性的凋亡相关酶类表达的影响钙成像结果显示Amiloride及PcTx1给药剂量组胞质Ca2+F340/F380比值相对于模型组差异有统计学意义；免疫细胞化学染色结果显示Amiloride组钙离子依赖性的凋亡相关酶类calpain、calcineurin、iNOS的表达明显降低(P<0.01)。
　　 结论：
　　 1.在佐剂性关节炎中，ASICs阻断剂Amiloride，对其炎症反应并无明显的抑制作用，而对软骨细胞及细胞外基质有保护作用。酸敏感离子通道阻断剂阿米洛利（Amiloride）对AA大鼠关节软骨有保护作用。
　　 2.酸敏感离子通道阻断剂阿米洛利（Amiloride）对于AA大鼠关节软骨细胞以及经胞外酸化处理的体外培养的关节软骨细胞的凋亡均有抑制作用。Amiloride是通过阻断ASICs来抑制AA大鼠关节软骨细胞的凋亡，从而发挥对AA大鼠关节软骨细胞的保护作用的。
　　 3.酸敏感离子通道阻断剂阿米洛利（Amiloride）对[Ca2+]I的升高以及钙离子依赖性的凋亡相关酶类calpain、calcineurin、iNOS的表达有抑制作用。Amiloride对于AA大鼠关节软骨细胞的凋亡的抑制有可能是通过阻断ASICs，抑制Ca2+超载，从而抑制钙离子依赖性的凋亡相关酶类calpain、calcineurin、iNOS的表达来实现的。