双酚A诱导小鼠睾丸生殖细胞凋亡的分子机制

摘要

目的:双酚A(bisphenol A,BPA)是已知睾丸毒物和潜在的内分泌干扰物。本研究初步探讨青春期不同剂量BPA暴露对小鼠睾丸生殖细胞凋亡发生的影响,且主要阐明线粒体信号通路和Fas/FasL受体通路在BPA致小鼠睾丸生殖细胞凋亡中的作用。
　　方法:出生后35天(postnatal day,PND35)雄性小鼠被随机分成对照组、低剂量BPA组和高剂量BPA组。两个 BPA组小鼠每天被经口灌胃分别给予 BPA(160 mg/kg或480 mg/kg),对照组小鼠给予等容积玉米油,连续染毒2周,末次给药12 h后剖杀各组雄鼠。取双侧睾丸称重,部分睾丸被固定,制备睾丸组织切片后行常规HE染色,并用TUNEL方法对部分睾丸组织切片检测睾丸内生殖细胞凋亡发生情况;采用免疫印迹(immunoblotting)技术检测雄鼠睾丸组织细胞凋亡相关蛋白(Fas、FasL、活性Caspase-8、Cyt c、Bax、Bcl-2、活性Caspase-9、活性Caspase-3)表达。
　　结果:青春期BPA(160和480 mg/kg)暴露2周后,雄鼠体重和睾丸绝对重量均明显降低,而青春期高剂量和低剂量BPA暴露未影响小鼠睾丸相对重量。睾丸组织病理学结果显示,青春期两种剂量BPA暴露均轻度减少雄鼠睾丸组织内生精细胞层数和破坏生精细胞排列。TUNEL原位凋亡检测结果发现,青春期高剂量BPA暴露显著促进小鼠睾丸组织细胞发生凋亡,其中以生殖细胞凋亡为主,且BPA处理组雄鼠睾丸组织中凋亡性生殖细胞主要分布在第Ⅶ-Ⅷ期的生精小管内。为了研究Fas/FasL受体通路在BPA致小鼠睾丸组织生殖细胞凋亡中的作用,本课题用免疫印迹技术检测Fas/FasL受体通路相关蛋白表达。本研究结果表明,青春期BPA暴露引起雄鼠睾丸组织Fas和FasL蛋白表达水平均明显升高,且呈现剂量-反应关系。此外,青春期雄鼠接触BPA后,其睾丸组织内活性Caspase-8和活性Caspase-3蛋白表达均显著上调。为了探讨线粒体信号通路在BPA致小鼠睾丸组织生殖细胞凋亡中的作用,本课题用免疫印迹技术检测线粒体信号通路相关蛋白表达。结果显示,青春期 BPA暴露(160或480 mg/kg)后,雄鼠睾丸组织细胞内细胞质中Cyt c含量均明显增加,而线粒体中Cyt c含量却显著降低。此外,青春期BPA暴露引起小鼠睾丸组织细胞内活性Caspase-9的蛋白表达明显上调。进一步研究结果表明,青春期BPA暴露明显上调雄鼠睾丸组织细胞内Bax蛋白表达,且呈现剂量-反应关系。此外,青春期高剂量BPA暴露后,雄鼠睾丸组织线粒体内Bax蛋白表达水平较对照组显著升高。最后,青春期高剂量BPA暴露尽管明显上调雄鼠睾丸组织细胞内Bcl-2蛋白表达,但是青春期高剂量BPA处理组雄鼠睾丸组织内促凋亡蛋白Bax与抗凋亡蛋白Bcl-2的光密度比值较对照组显著增加。
　　结论:青春期BPA暴露引起小鼠睾丸生殖细胞凋亡,且发生凋亡的生殖细胞主要分布于睾丸组织内成熟期生精小管(第VII-VIII期)内。Fas/FasL受体通路和线粒体信号通路均可能不同程度地参与BPA引起睾丸生殖细胞凋亡的发生。

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缩略词表

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英文摘要

1. 前言

2 材料和方法

2.1化学试剂

2.2 动物的来源与处理

2.3睾丸组织病理学检查

2.4 TdT介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）法检测

2.5 蛋白质免疫印迹

2.5.1 总蛋白免疫印迹

2.5.2 细胞质和线粒体蛋白免疫印迹

2.6 统计分析

3 结果

3.1 青春期BPA暴露对雄性小鼠体重和睾丸重量的影响

3.2 青春期BPA暴露对小鼠睾丸组织病理学影响

3.3 青春期BPA暴露对小鼠睾丸生殖细胞凋亡的影响

3.3.1小鼠睾丸组织细胞凋亡及其分布情况

3.3.2 小鼠睾丸内不同时期生精小管中的凋亡分布

3.3.3 小鼠睾丸组织活化型Caspase-3蛋白水平

3.4 青春期BPA暴露对雄鼠睾丸生殖细胞Fas/FasL通路的影响

3.5 青春期BPA暴露对雄鼠睾丸生殖细胞线粒体信号通路的影响

4 讨论

5 小结

参考文献

附录

致谢

综述