以果蝇表达载体系统构建可稳定表达抗菌性多肽Trappin-2的S2细胞株

摘要

目的:Trappin-2为elafin蛋白的前体,又称pre-elafin和肽酶抑制剂3(peptidase inhibitor3,PI3),属于trappin家族,在体内外环境中,经蛋白酶水解可降解为具有类似生物活性的elafin蛋白。作为一种以黏膜表面分布为主的防御肽,Trappin-2在黏膜表面具有很好的稳定性,具有多种生物学功能,能抵抗微生物感染、调节炎症反应、抑制中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)、胰弹性蛋白酶等多种蛋白酶,在肺损伤等疾病中发挥重要的抗炎作用。近期研究发现Trappin-2具有佐剂活性,是一种潜在的黏膜佐剂。本研究是利用果蝇S2表达系统,构建可与S2细胞基因组整合的分别含有Trappin-2和EGFP的重组质粒,筛选出两种抗性稳定可表达Trappin-2和EGFP的多克隆S2细胞株,为后期研究Trappin-2黏膜佐剂等生物学活性奠定基础。
　　方法:首先对pMT/Bip/V5-His A果蝇表达载体进行改造,去掉pMT/Bip/V5-His A的Bip信号肽,改造成为pMT/V5-His A,采用RT-PCR方法从A549细胞中得到含信号肽的、完整的Trappin-2基因,,在引物的5′端引入NotⅠ酶切位点及Kozak序列;引物的3′端引入XhoⅠ酶切位点和双终止密码子。利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pMT/V5-HisA中,得到重组表达质粒pMT-Trappin-2(简称pMT-T2)真核表达载体。为了观察、比较转染效率和表达水平,我们同时构建了带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的载体pMT/V5-His A-EGFP(简称pMT/EGFP)。采用脂质体介导的转染技术将鉴定正确的两种质粒pMT-T2和pMT-EGFP分别与抗性筛选质粒pCoHygro(简称pro)共转入果蝇S2细胞中,用含有300mg/ml潮霉素B的完全培养基进行筛选,经过3-4周,筛选出两种抗性稳定多克隆S2细胞株,用终浓度为500mM的CuSO4诱导表达48h后,分别通过荧光显微镜、RT-PCR和Western blot分析目的蛋白在S2细胞中的表达水平。
　　结果:采用RT-PCR方法从A549细胞中得到Trappin-2基因,通过NotⅠ和XhoⅠ双酶切位点将Trappin-2克隆入改造好的pMT/V5-His A载体上,构建了pMT-T2和pMT-EGFP质粒,应用脂质体转染技术将真核表达载体和抗性筛选质粒pro共转染果蝇S2细胞,通过潮霉素B反复筛选,约3-4周后,成功筛选到两种稳定的抗性多克隆细胞株,分别命名为S2-Trappin-2和S2-EGFP,用硫酸铜分别诱导两个细胞株,在荧光显微镜下可观察到S2-EGFP主要表现为胞浆绿色荧光,RT-PCR结果证实Trappin-2在S2细胞中可稳定表达,Western blot分析S2-Trappin-2细胞培养上清可见分子量约10 kDa的特异性条带,成功建立可稳定高表达Trappin-2和EGFP蛋白的果蝇S2细胞系。
　　结论:成功克隆了Trappin-2基因,并利用果蝇表达系统筛选到可分别稳定表达Trappin-2和EGFP的S2细胞株。以果蝇表达系统稳定表达Trappin-2蛋白尚未见文献报道。S2-Trappin-2稳定表达细胞株的建立为进一步研究Trappin-2生物学特性、黏膜佐剂作用及在肺部感染等疾病中的应用奠定了基础。

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实验设计与流程

前 言

实验材料和方法

1.1 实验仪器

1.2 主要生化试剂、材料

1.3 工具酶和试剂盒

1.4 细胞和质粒

1.5 主要溶液配制

2 实验方法

2.1 CaCl2法制备E.coli DH5?感受态细胞

2.2 把pMT/Bip/V5-HisA改造为pMT/V5-HisA

2.3 RT-PCR克隆Trappin-2基因及重组表达载体的构建

2.4 EGFP片段的获得和pMT-EGFP的构建

2.5 稳定转染用质粒pMT-EGFP和pMT-T2的大量制备

2.6 表达Trappin-2的S2细胞系的筛选

2.7 表达EGFP的S2细胞系的筛选和pMT/V5-HisA空质粒为对照组的设立

3 结果

3.1 目的基因Trappin-2的获得和鉴定

3.2 两种质粒pMT-T2和pMT-EGFP的酶切鉴定

3.3荧光显微镜鉴定pMT-EGFP中EGFP在S2细胞中的表达

3.4 表达产物的Western blot鉴定

3.5 Tarappin-2表达产物的RT-PCR鉴定

4.讨论

5.结论

5.1 完成载体pMT/Bip/V5-His A的改造

5.2 从A549细胞成功克隆Trappin-2基因，并完成重组质粒pMT-T的构建

5.3 获得可稳定表达Trappin-2蛋白的S2-Trappin-2细胞株

5.4 获得可稳定表达EGFP蛋白的S2-EGFP细胞株

参考文献

附录

致谢

综述