大鼠肌卫星细胞体外培养及移植延缓失神经骨骼肌萎缩的实验研究

摘要

目的：探索大鼠肌卫星细胞体外培养的技术方法，并观察其体外增殖、分化的特征。将体外培养的肌卫星细胞移植至失神经支配的骨骼肌，观察其体内存活，分化，及形成肌管的过程，并评判肌卫星细胞移植对于延缓失神经骨骼肌萎缩的作用。　　 方法：　　 第一部分：大鼠肌卫星细胞的体外培养与鉴定　　 以成年Wistar大鼠后肢肌为取材组织，采用I型胶原酶和胰蛋白酶，以“两步法”消化分离肌卫星细胞，并采用差速贴壁法纯化。培养肌卫星细胞的增殖培养基采用Ham s F10+20％FBS+5ng/ml bFGF，分化培养基采用Ham sF10+2%FBS+2%HS。观察体外培养的肌卫星细胞增殖、分化及融合形成肌管的状态。　　 采用免疫荧光技术，对静止和激活的肌卫星细胞分别选择其特征性标志物PAX7和MyoD为标志，对分化肌细胞选择肌细胞骨架蛋白Desmin和α-SCA为标志，分别进行细胞鉴定。　　 第二部分：肌卫星细胞移植与体内分化的观察　　 体外培养的肌卫星细胞经纯度鉴定之后，以带e-GFP基因的腺病毒转染示踪，并移植至失去胫神经支配之腓肠肌。分别在移植之后1周、2周、4周取材腓肠肌组织，制作连续冰冻切片。荧光显微镜下观察，带GFP绿色荧光的移植细胞存活、分化及形成肌管的状态。　　 第三部分：肌卫星细胞移植延缓失神经肌萎的疗效观察　　 选取成年Wistar大鼠24只，于右后肢切断胫神经，建立失神经肌萎模型。将其随机分为两组，其中12只Wistar大鼠于右侧腓肠肌注射肌卫星细胞悬液(移植组)，另外12只仅注射细胞培养液(对照组)。　　 移植4周后，选取移植组与对照组各6只大鼠，取材双侧腓肠肌，称肌湿重后，制作石蜡切片，行HE染色与Masson染色，比较肌纤维平均截面积与胶原纤维增生状态。剩余大鼠取材右侧腓肠肌，制作冰冻切片，行ATP酶组织化学染色，比较移植组和对照组肌组织中ATP酶的含量。　　 结果：采用I型胶原酶和胰蛋白酶联合消化，并用差速贴壁法纯化的方法，可在体外获得高纯度的大鼠肌卫星细胞。体外培养的大鼠肌卫星细胞可在合适条件下分化，并相互融合形成肌管。培养所得细胞在分化前表达静止期肌卫星细胞特征性标志物Pax7，在激活后表达MyoD，在分化后表达肌细胞特有骨架蛋白Desmin(结蛋白)和α-SCA(α横纹肌肌动蛋白)。　　 外源性肌卫星细胞移植后，可在肌组织内存活、分化、相互融合形成肌管。肌卫星细胞移植组的腓肠肌，在肌湿重、肌纤维平均截面积、胶原纤维增生及ATP酶改变各方面，均较对照组有改善，其差异具有统计学意义。　　 结论：通过分离消化大鼠肌组织，可在体外获得高纯度的具有成肌能力的肌卫星细胞。将肌卫星细胞移植于失神经支配的骨骼肌，能够发挥延缓肌肉萎缩的作用。