NGAL-NGALR在肾小肾炎中的表达及其机制的实验研究

摘要

中性粒细胞明胶酶相关性载脂蛋白(neutrophilgelatinase-associatedlipocalin，NGAL)，又称lipocalin2(Lcn2)，是一个只有25KDa的属于lipocalin超家族的小分子分泌蛋白。它最主要的分子结构特点是由八段反平行式β折叠构成的一个复杂的β折叠桶结构，这也是它的结合位点，用来结合和运输小分子的疏水性蛋白。如下图所示。　　NGAL最初是在活化的中性粒细胞的培养上清中发现的，并且被证实具有抗菌作用。中性粒细胞明胶酶相关性载脂蛋白受体(neutrophilgelatinase-associatedlipocalinreceptor，NGALR)是最近才被证实的NGAL特异性受体，在鼠淋巴细胞系来源的FL5，12细胞中首次被发现。它在细胞胞吞和运输过程中起作用。　　大量的临床样本研究揭示：患者发生急性肾损伤后几小时内血液和尿液中NGAL水平就会大幅升高。其他常用的诊断方法如测定血清肌酐、尿素氮或者半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(CystatinC)都只能在肾脏功能退化后才能检测出，那需要一天甚至几天，这时临床医生可能已经丧失医疗处理的最佳时间。所以，目前NGAL以其快速、准确、灵敏的生物学特点作为新一代的生物学标记物应用于临床，以便临床医生及时准确的观测肾脏功能损伤的情况。　　最近的研究表明在慢性肾病患者的血液和尿液中NGAL水平较正常对照也有不同程度的升高，并且当患者病情发生恶化后NGAL水平较之前升高更明显。新出现的报道还揭示NGAL可能与慢性肾病进展的病理生理学过程相关。在对FVB/N(类似人类慢性肾脏疾病的发病，病情持续进展)和B6D2F1(只是发生代偿，而不进展恶化)两种小鼠模型的基因概况分析中，发现了大约70余种基因的表达差异，其中NGAL的差异性最大，即NGAL在前者中的表达要明显高于后者。当把FVB/N小鼠中NGAL基因敲除后，肾脏的损伤程度较野生型小鼠要减轻许多；同时在人的常染色体显性多囊肾病(ADPKD)中也证实，相对于正常对照NGAL在病变肾小管中阳性表达水平较高。当把jck小鼠模型(类似ADPKD将发展成严重的持续进展的小管损伤和膨大)与NGAL基因敲除小鼠杂交后，肾小管的损伤程度也得到了缓解。在体外的细胞实验中证实NGAL促进肾小管细胞增殖及其囊泡状结构生成的作用与EGFR信号通路有关。此外，在缺血-再灌注小鼠模型中还发现，炎症因子对NGALR的表达有调控作用，也直接影响了NGAL对小管上皮细胞的增殖作用。　　目前关于NGAL-NGALR与系膜细胞的关系还鲜有相关的研究和报道。众所周知，系膜细胞(MC)是肾小球内的固有细胞，它的生物学功能和周期的改变是慢性肾脏疾病发生发展过程中的中心环节。所以要明确NGAL-NGALR在慢性肾病病理生理过程中所起的作用，特别是与肾小球肾炎发生发展的关系，一定离不开研究NGAL-NGALR与系膜细胞的关系。　　综上所述，本课题主要采用免疫组织化学、免疫印迹、Real-timePCR、细胞培养、流式细胞术、免疫细胞荧光和siRNA干扰等实验方法，观察在各型常见肾小球肾炎和人系膜细胞中NGALR的表达情况，探讨炎症因子对NGALR表达的影响，明确NGAL对系膜细胞蛋白表达的生物学功能和细胞周期的影响，及其相关信号通路的研究，为进一步了解NGAL在慢性肾病病理生理过程中所起的作用提供新的实验依据。　　第一部分IL-1β通过激活MAPK/ERK通路上调HMC的NGALR表达　　目的：观察NGALR在常见类型肾小球肾炎和炎症状态下HMC中的表达情况。　　方法和结果：采用免疫组织化学的方法检测了93例常见类型肾小球肾炎和正常肾组织肾穿标本中NGALR的蛋白表达情况，进而应用WesternBlot和Real-timePCR的方法检测炎症因子TGF-β1，TNF-α和IL-1β作用后HMC中NGALR表达以及MAPK通路活化的情况。结果显示NGALR在肾小球中差异表达，在急性弥漫增生性肾炎(APGN)和狼疮性肾炎(LN)中的表达水平明显要高于正常对照及其它类型的肾小球肾炎。体外实验研究结果证实，采用IL-1β、TGF-β1和TNF-α分别处理HMC，仅可见IL-1β在mRNA和蛋白水平上对NGALR的表达有上调作用，并伴有MAPK/ERK信号通路的活化，且这种升高可以被ERK的活性抑制剂所抑制。同时检测NGAL在HMC中的表达情况时发现，能检测到mRNA的表达，但无蛋白的翻译，并且IL-1β能诱导mRNA表达水平的升高。但是加入外源性NGAL孵育HMC后，则能够在细胞中检测到NGAL的蛋白表达。　　小结：NGALR在常见类型肾小球肾炎肾小球中差异表达，以APGN和LN的阳性表达率最高；IL-1β通过激活MAPK/ERK通路上调HMC的NGALR表达；HMC自身不表达NGAL蛋白，但外源性NGAL能被HMC摄入。　　第二部分NGAL对HMC表达FN、ColIV、CTGF和细胞周期的调控及其机制研究　　目的：明确NGAL对HMC蛋白合成的生物学功能和细胞周期的影响及其相关机制的研究；探讨NGAL在肾小球硬化乃至肾脏纤维化过程中的作用。　　方法和结果：采用免疫印迹，免疫细胞荧光、流式细胞计数、CCK8细胞生长曲线、Real-timePCR以及siRNA干扰的方法，证实NGAL可诱导HMC表达FN、ColⅣ和CTGFmRNA水平和蛋白水平升高，且此过程有Smad2/3蛋白的活化，但与MAPK信号转导通路和I-Smad蛋白的关系不明显。采用siRNA干扰技术抑制NGALR表达后，NGAL，上调HMC表达CTGF和ColⅣ蛋白的水平下降。同时研究发现，NGAL对HMC的细胞周期具有调控作用，NGAL作用下的HMC停滞在G0/G1期，并伴有PI3K/Akt信号通路的活性抑制，以及细胞周期调节蛋白CyclinD1、p21和p27的表达上调，CDK2的表达下调，但CDK4的表达变化不大。　　小结：NGAL诱导HMC表达FN、ColIV和CTGFmRNA水平和蛋白水平上调，促使细胞外基质沉积，此过程中有Smad2/3蛋白的活化；NGAL诱使HMC停滞在G0/G1期，这个过程抑制了PI3K/Akt信号通路的活性并且有CyclinD1、p21、p27蛋白的上调和CDK2蛋白的下调。