人骨髓间充质干细胞增殖、分泌、凋亡、迁移和黏附影响因素及机制

摘要

骨髓干细胞是一类具有高度自我更新和多向分化潜能的细胞,利用其可分化为多种细胞的能力,可作为受损心肌组织修复的供体细胞。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stemcells,MSCs)是骨髓中除造血干细胞以外的另一类多能干细胞,可能成为一种理想的修复损伤心肌的移植用细胞,其治疗缺血性心脏病、扩张性心肌病等原因引起的心功能不全的研究尚处于起步阶段,正日益受到关注。　　本研究以人MSCs为研究对象,探讨其增殖、旁分泌、迁移、凋亡过程中不同药物的影响,及相关的细胞信号传导途径。　　第一部分，人骨髓间充质干细胞的分离培养、鉴定及诱导分化　　[目的]：分离并培养人MSCs,纯化扩增,为进一步进行药物干预研究打基础,并检测细胞表型。使用5-氮杂胞苷(5-azacytidine,5-aza)将人MSCs向心肌细胞方向诱导分化,进行细胞鉴定,以满足实验的需要。　　[方法]：抽取志愿者骨髓液,使用密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞,并借助MSCs黏附于塑料瓶底这一特性进行纯化。相差显微镜观察形态变化,流式细胞仪检测CD34、CD105、CD106表面抗原表达,鉴定MSCs。将MSCs传代扩增培养,取第6代MSCs经5-aza诱导分化,相差显微镜观察形态变化,免疫化学鉴定细胞诱导前后肌球蛋白重链β和心肌肌钙蛋白T(cardiac troponinT,cTnT)表达。　　[结果]：将密度梯度离心法与贴壁法相结合,可获得较多的MSCs,通过传代后细胞进一步纯化,每个25cm2细胞培养瓶接种2×105个细胞,完全培养液胎牛血清浓度为10％,80%～90%细胞融合后按1:3或1:2比例传代,MSCs能稳定地传代扩增而无明显分化迹象。原代细胞培养2周左右可首次传代,以后7d左右传代一次,传到第6代未发现属性改变,呈现成纤维细胞样生长。应用5-aza对第6代细胞进行诱导分化2周,发现细胞形态变大,连接紧密,呈条索状,外表似心肌细胞,诱导前MSCs肌球蛋白重链β和cTnT表达均阴性,诱导后则均为阳性表达,阳性细胞率约为21%。　　[结论]：应用密度梯度离心法密度梯度离心法与贴壁法相结合,可建立人MSCs体外稳定的纯化扩增方法。体外5-aza诱导后2周,MSCs从形态和蛋白表达水平上向心肌细胞方向分化,符合实验要求。　　第二部分，促红细胞生成素、普伐他汀、红景天苷、抗血小板药物对人骨髓间充质干细胞增殖、旁分泌和分化的干预研究　　[目的]：观察重组人促红细胞生成素(recombinant human EPO,rhEPO)、普伐他汀、红景天苷、抗血小板药物干预对人MSCs增殖、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)分泌、分化的影响。　　[方法]：体外扩增培养人MSCs,绘制生长曲线,使用上述药物干预第6代人MSCs,相差显微镜观察药物作用后细胞形态学变化,四甲基偶氮唑盐[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylte trazoliumbromide,MTT]比色法检测细胞增殖情况,酶联免疫吸附法(enzyme-linkedim munosorbentassay,ELISA)法测定细胞VEGF分泌,流式细胞仪检测细胞抗原CD34、CD105、CD106表达变化,免疫化学观察药物预处理后经5-aza诱导,人MSCscTnT抗体染色阳性细胞率的变化。　　[结果]：(1)细胞增殖情况:传代细胞潜伏期为48h左右,对数增殖期约为接种后第4～6d,至接种后第7d进入平台期。经药物作用后的人MSCs形态和细胞表面抗原CD34、CD105、CD106表达无明显变化。反映MSCs增殖变化的OD570值在一定浓度rhEPO(0.01U/mL～10U/mL)、普伐他汀(0.2μmol/L～10μmol/L)、红景天苷(0.2mg/L～2mg/L)、氯吡格雷(0.02μmol/L～40μmol/L)和噻氯匹定(0.02μmol/L～40μmol/L)作用后明显高于对照组(P<0.05),而部分浓度的阿司匹林组(60μmol/L～2000μmol/L)则显著低于对照组(P<0.05)。(2)细胞VEGF分泌:人MSCs分泌的VEGF水平在高浓度红景天苷(5mg/L)、高浓度氯吡格雷(40μmol/L)和噻氯匹定(40μmol/L)作用后明显低于对照组(P<0.01),而低浓度普伐他汀(0.2μmol/L)、阿司匹林组和低浓度氯吡格雷组(0.02μmol/L)VEGF水平与对照组无明显差异,rhEPO、高浓度普伐他汀(100μmol/L)、低浓度红景天苷(0.2mg/L)和低浓度噻氯匹定(0.02μmol/L)VEGF水平则显著高于对照组。(3)细胞分化情况:细胞表面抗原CD34、CD105、CD106在6种药物作用后与对照组相比无明显差异。促红细胞生成素、普伐他汀、红景天苷、氯吡格雷、噻氯匹定和阿司匹林预处理后经5-aza诱导,人MSCscTnT单克隆抗体染色阳性细胞百分率无明显变化(P值分别为0.597、0.952、0.325、0.141、0.830和0.072)。　　[结论]：rhEPO、普伐他汀、红景天苷、氯吡格雷和噻氯匹定对人MSCs有明显的促进增殖作用,而阿司匹林则抑制其增殖。高浓度红景天苷、氯吡格雷和噻氯匹定有抑制人MSCs分泌VEGF的作用,rhEPO、高浓度普伐他汀、低浓度红景天苷和低浓度噻氯匹定可促进VEGF分泌。这些药物对人MSCs的分化影响不明显。　　第三部分:促红细胞生成素和普伐他汀对人骨髓间充质干细胞增殖、旁分泌、凋亡、迁移和黏附的影响和作用机制的实验研究　　[目的]：观察促红细胞生成素和普伐他汀干预对人MSCs增殖、VEGF分泌、凋亡、迁移和黏附的影响及相关细胞信号传导通路。　　[方法]：体外培养人MSCs,使用上述药物干预第6代人MSCs,Westernblot方法检测作用前后磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(extracellula rsignal-regulated kinase1/2,ERK1/2)、p38促分裂原活化蛋白激酶(p38mitogen activated protein kinase,p38MAPK)及磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidyl inositol-3-kinase,PI3K)/丝氨酸/苏氨酸激酶(serine/threoninekinase,Akt)蛋白的表达情况,进一步用特异的细胞信号通路抑制剂或激动剂阻断或激活ERK1/2、p38MAPK及PI3K/AKT途径,通过MTT法测定对人MSCs的增殖影响,ELISA法测定细胞VEGF的分泌,用流式细胞仪进行rhEPO和普伐他汀对MSCs的抗凋亡研究,Transwell小室进行细胞迁移实验,并进行细胞黏附性测定。　　[结果]：rhEPO和普伐他汀可使人MSCs的PI3K/Akt通路磷酸化水平升高,抑制p38MAPK通路磷酸化水平,对人MSCs的ERK通路和总Akt、总p38MAPK水平无明显影响。经p38MAPK通路特异激动剂anisomycin预处理后,rhEPO组促增殖作用较前减弱(P<0.05),而普伐他汀组作用消失,PI3K/AKT通路特异抑制剂Ly294002预处理影响不明显。Ly294002或anisomycin预处理均可使rhEPO促进人MSCs分泌VEGF的作用减弱(P<0.01),Ly294002预处理可使普伐他汀的这种作用减弱(P<0.01),但anisomycin作用不明显。rhEPO和普伐他汀能降低H2O2诱导的人MSCs凋亡(P<0.01),Ly294002预处理后这种作用消失,anisomycin预处理对这种作用影响不明显。经rhEPO或普伐他汀作用后迁移细胞显著增多(P<0.01),Ly294002预处理后这种作用消失,anisomycin预处理对这种作用影响不明显。经rhEPO或普伐他汀作用后贴壁细胞显著增多(P<0.01),但Ly294002或anisomycin预处理对这种作用影响均不明显。　　[结论]：rhEPO及普伐他汀可促进人MSCs的增殖、分泌VEGF、迁移和黏附能力,并具有抗凋亡作用。这两种药物的促进增殖作用与其抑制p38MAPK通路有关,p38MAPK通路受抑制也与rhEPO促进VEGF分泌相关,而PI3K/Akt通路的激活参与了它们的刺激VEGF分泌、增强迁移能力以及抗凋亡作用的调控。这两种药物促进黏附能力与PI3K/Akt和p38MAPK通路无关。

目录

主要缩略词

中文摘要

英文摘要

正文

引言

第一部分:人骨髓间充质干细胞的分离培养、鉴定及诱导分化

目的

材料和方法

结果

讨论

第二部分:促红细胞生成素、普伐他汀、红景天苷和抗血小板药物对人骨髓间充质干细胞增殖、旁分泌和分化的干预研究

研究目的

材料和方法

结果

讨论

第三部分:促红细胞生成素和普伐他汀对人骨髓间充质干细胞增殖、旁分泌、凋亡、迁移和黏附的影响和作用机制的实验研究

研究目的

材料和方法

结果

讨论

总结

参考文献

致谢

附件

综述

论著

附录