高密度脂蛋白对骨髓来源间充质干细胞的增殖、迁移、旁分泌和抗凋亡能力的影响及机制研究

摘要

引言：
　　缺血性心脏病是高发病率、高死亡率的的疾病之一，特别是急性心肌梗死发生以后，死亡的心肌不可再生，远期发生心肌重构、甚至心力衰竭。干细胞移植给缺血性心脏病的治疗带来了曙光，科学家们努力寻找可以用于治疗心肌梗死的干细胞。骨髓来源的间充质干细胞(MSCs)早在40多年以前就被发现、分离，并用于移植治疗心肌梗死。MSCs作为移植治疗的“种子细胞”，具有容易获得、扩增简单、可多向分化和存在独特的免疫耐受性等优点，因而在细胞移植修复心肌的基础实验和临床治疗中得到了广泛的研究。
　　MSCs移植治疗缺血心肌的疗效有赖于其移植后的存活能力。然而，有研究发现，在心肌梗死的家猪模型中，一次移植6×107只细胞入梗死心肌周边，能获得的心功能改善也非常有限。还有学者研究报道，MSCs在移植后4天内就发生明显的凋亡，最终能存活的仅有0.44％。因此，如何提高MSCs抵御缺血缺氧和氧化应激诱导凋亡的能力、提高其在移植后心肌局部的存活能力将有助于大大提高MSCs移植治疗急性心肌梗死的临床疗效。
　　血浆高密度脂蛋白(HDL)这一心血管疾病的保护性因子逐渐为人们所认识。大多数研究认为，HDL之所以对心血管疾病有益，主要原因在于它含有一个重要的脂蛋白——apoA-Ⅰ，具有胆固醇的逆转运功能。然而，新近的研究发现，HDL的功能远远不止人们所发现的这些。因为在HDL的组成成分中，只有三分之一与胆固醇的转运相关，而其余部分却和抑制蛋白酶活性、补体调节以及应激调控有关。这一发现提示我们，HDL可能存在着广泛的功能，比如抗炎、抗氧化和抗凋亡等特性; HDL的作用可能不只局限于在心血管疾病或者内分泌代谢疾病领域里所认识的这些，而是参与了与氧化应激、炎性反应和细胞凋亡坏死有关的所有病理生理过程。
　　因此，我们猜想:是否血浆较高的HDL水平可以影响MSCs的某些生物学特性，进而增强MSCs的心肌修复能力？是否HDL可以促进MSCs迁移、增殖？或者可以提高MSCs抗凋亡的能力？本研究将着重考察HDL对MSCs生物学特性的影响，并用经HDL预处理的MSCs移植治疗急性心肌梗死的动物模型，观察远期心室重构和心功能的情况，尝试从改善MSCs特性、促进心肌修复的崭新视角阐明HDL对缺血性心脏病预后的影响，为冠心病患者的血脂管理提供实验依据和理论参考。
　　第一部分高密度脂蛋白对骨髓间充质干细胞增殖和迁移能力影响及机制研究
　　目的：观察高密度脂蛋白(HDL)对骨髓间充质干细胞(MSCs)的增殖和迁移能力的影响，并探讨可能的机制。
　　方法：大鼠骨髓来源的MSCs在不同浓度的HDL中孵育不同的时间，用MTT和BrdU法检测细胞增殖率，用划痕试验检测细胞迁移率;Western-blot检测p21的表达和Akt, ERK1/2磷酸化水平;抑制信号通路活性后观察HDL促MSCs作用可能的信号通路;并以RNA干扰的方法观察清道夫受体B族Ⅰ型(SR-BⅠ)在HDL对细胞增殖活性影响中的作用。
　　结果：HDL对MSCs的迁移活性没有影响，但可以呈时间和浓度依赖性地促进MSCs的增殖，并伴随着MAPK/ERK，PI3K/Akt通路的活化和p21蛋白的表达下调。当先给予MAPK/ERK通路抑制剂U0126预处理后再用HDL孵育时，p21的表达比未经预处理组明显增高（1.68±0.17 vs.0.76±0.15，p＜0.05）;同样地，当先给予PI3K/Akt通路抑制剂LY294002预处理时，p21的表达也比未经预处理时明显增高（1.03±0.16 vs.0.691±0.13，p＜0.05）。HDL的孵育上调了SR-BⅠ的表达;经SR-BⅠsiRNA干扰后，MSCs在与HDL孵育时的增殖作用与未孵育组相比没有显著差别（1.08±0.14 vs.1.08±0.15，p＞0.05）;而在经mock siRNA干扰的MSCs，HDL的促增殖作用比未经HDL孵育时显著升高（1.57±0.23 vs.0.98±0.16，p＜0.05）。
　　结论：HDL可呈时间和浓度依赖性地促进MSCs的增殖;SR-BⅠ是其作用的受体，PI3K/Akt和MAPK/ERK1/2是其发挥调控的部分通路。
　　第二部分高密度脂蛋白影响骨髓间充质干细胞旁分泌能力并保护心肌细胞减少缺氧诱导凋亡的机制研究
　　目的：观察HDL对MSCs的旁分泌能力的影响，并研究所分泌的因子是否对心肌细胞抵御缺氧诱导的凋亡有作用。
　　方法：骨髓来源的MSCs经不同浓度的HDL孵育不同的时间后，以实时定量PCR的方法评价VEGF, bFGF, HGF和TGF-β2等活性因子mRNA的表达情况，以ELISA的方法评价培养基上清活性因子的含量。用以下各种条件培养基培养缺氧条件下的新生大鼠心肌细胞:1）(MSCs+HDL)组:HDL(100μg/ml)孵育培养MSCs的培养液上清，超滤后获得的条件培养基;2）MSCs组:MSCs的培养液上清，超滤后获得的条件培养基;3）HDL组:含HDL(100μg/ml)的培养基;4）(Positive Control)组:单纯培养基。用TUNEL检测以上4组心肌细胞在缺氧条件下的凋亡水平，用Western-blot检测4组心肌细胞在缺氧条件下的bcl-2和bax的表达差异。并用siRNA的方法下调MSCs的TGF-β2表达，用流式细胞术分析HDL预处理siRNA后的MSCs的培养液上清（siRNA组）对心肌细胞耐受缺氧诱导凋亡的能力有无影响。
　　结果：实时定量PCR和ELISA结果都发现HDL可以呈时间和浓度依赖性地促进MSCs分泌TGF-β2。TUNEL提示(MSCs+HDL)组的细胞凋亡率比(PositiveControl)组，HDL组和MSCs组都明显降低[(10.23±5.68)％vs.(28.36±4.98)％，vs.(16.38±5.38)％，vs(17.82±6.24)％，p均＜0.05]; Western-blot提示(MSCs+HDL)组的bcl-2/bax水平比(Positive Control)组，HDL组和MSCs组明显升高[(0.846±0.16) vs.(0.156±0.03)，vs.(0.411±0.10)，vs.(0.346±0.08)，p均＜0.05].而当下调TGF-β2表达后，siRNA组的凋亡率则明显高于(MSCs+HDL)组[(10.28±1.33)％vs.(5.34±0.67)％,p＜0.05].
　　结论：高密度脂蛋白呈时间和浓度依赖性地促进TGF-β2的分泌，该因子可以保护心肌细胞抵御缺氧诱导的凋亡。
　　第三部分高密度脂蛋白对骨髓间充质干细胞抗凋亡能力的影响及机制研究
　　目的：探讨高密度脂蛋白对骨髓间充质干细胞抗氧化应激诱导凋亡能力的影响，并探讨其可能的机制。
　　方法：用过氧化氢(H2O2)干预的方式模拟氧化应激建立体外模型:用不同浓度的H2O2(0，20μM，50μM，100μM和200μM)干预1小时后，用Hochest33342检测凋亡以确定损伤模型的干预浓度。之后MSCs随机分为4组:1)(H2O2+HDL)组:用HDL（100μg/ml）预处理24小时后，再用H2O2（100μM）干预1小时;2) HDL组:仅用HDL孵育，但不接受H2O2损伤干预;3）H2O2组:未用HDL预处理，直接加用H2O2干预;4）Control组:不接受HDL预处理，也未加用H2O2损伤。用活性氧探针(ROS)检测MSCs胞内氧化应激水平、用TUNEL比较MSCs凋亡程度、用Western-blot检测胞内凋亡相关蛋白表达情况。用Bio-Plex悬液芯片筛选HDL影响MSCs抗凋亡能力的可能信号通路。
　　结果：100μM以上的H2O2可明显诱导MSCs凋亡。（H2O2+HDL）组胞内的ROS积聚较H2O2组明显减少（1.56±0.38 vs.5.68±0.56，p＜0.05），细胞凋亡水平显著降低[(28.77±6.91)％vs.(47.37±7.53)％，p＜0.05];胞内bcl-2和bax蛋白表达水平明显升高（1.36±0.44 vs.0.44±0.17，p＜0.05）。悬液芯片检测结果显示，和H2O2组相比，(H2O2+HDL)组的MAPK/JNK，MAPK/P38信号通路的磷酸化水平没有显著差异，分别为[MAPK/JNK:（70.56±5.91）vs.（51.03±4.56），p＞0.05]，[MAPK/P38:（10.70±3.46） vs.（3.34±1.28），p＞0.05];而MAPK/ERK信号通路的活化则有明显的减轻[（51.03±5.73）vs.（17.73±3.22），p＜0.05]。
　　结论：HDL预处理可以提高MSCs抵御氧化应激诱导的细胞凋亡，可能通过MAPK/ERK信号通路参与调控。
　　第四部分高密度脂蛋白预处理的骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠急性心肌梗死实验研究
　　目的：评价以HDL预处理的MSCs移植治疗急性心肌梗死大鼠的疗效，观察远期心功能变化。
　　方法：从雌性SD大鼠分离、获取MSCs后传代培养。建立雄性大鼠急性心肌梗死动物模型，以绿色荧光蛋白(GFP)转染标记的MSCs行心肌内注射移植。其中移植HDL预处理的MSCs为(MSCs+HDL)组，移植未作预处理的MSCs为MSCs组，输注PBS为Control组。当观察MSCs存活率时，于移植后4天处死大鼠，取材后计数局部心肌GFP+细胞的数量，以实时定量PCR法分析sry基因在局部心肌的表达水平。当观察MSCs移植疗效时，于移植后4周先用小动物心超测量心室腔径和左室射血分数，后处死大鼠，取材以Masson染色计算心肌梗死面积，以CD31免疫组化检测局部毛细血管密度。
　　结果：和MSCs组相比，(MSCs+HDL)组可见到梗死周边有更多的GFP+细胞，有显著升高的sry基因表达水平（1.00±0.22 vs.2.83±0.74，p＜0.05），心肌梗死明显面积缩小[(31.58±4.36)％vs.(20.25±5.36)％，p＜0.05]，梗死周边的毛细血管密度显著增加[(10.68±3.22)/HP vs.(15.17±3.83)/HP，p＜0.05]，心室重构和远期心功能也明显改善[LVEF:(35.32±3.6)％vs.(42.33±5.2)％; LVFS:(20.35±1.56)％ vs.(25.35±3.22)％; LVIDs:(7.29±1.6)mmvs.(5.79±0.8)mm; LVIDd:(8.35±1.9)mm vs.(7.95±1.6)mm;p均＜0.05]。
　　结论：HDL预处理可以明显提高MSCs移植后在局部心肌的存活率，较未经预处理的MSCs能更好地改善远期心功能。

目录

英文缩略语

摘要

研究创新点与意义

引言

参考文献

第一部分 高密度脂蛋白对骨髓间充质干细胞增殖和迁移能力的影响及机制研究

一、前言

二、材料与方法

三、结果

四、讨论

五、结论

参考文献

第二部分 高密度脂蛋白影响骨髓间充质干细胞旁分泌能力并保护心肌细胞减少缺氧诱导凋亡的机制研究

一、前言

二、材料与方法

三、结果

四、讨论

五、结论

参考文献

第三部分 高密度脂蛋白对骨髓间充质干细胞抗凋亡能力影响及机制研究

一、前言

二、材料与方法

三、结果

四、讨论

五、结论

参考文献

第四部分 高密度脂蛋白预处理的骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠急性心肌梗死实验研究

一、前言

二、材料与方法

三、结果

四、讨论

五、结论

参考文献

全文小结

综述 高密度脂蛋白对心血管疾病防治意义的再认识

附录 博士研究生期间科研成果及获得荣誉

致谢

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