细胞周期相关因子CDCA3可能参与负调控NF-κB信号通路

摘要

NF-κB信号通路参与免疫反应、炎症反应、细胞凋亡及肿瘤发生发展等多种病理生理学过程。NF-κB信号通路的激活对肿瘤发生发展有促进作用,并能明显促进肿瘤的转移。因此研究其调控机制具有重要意义。
　　NF-κB信号通路包括多种调控分子,其中肿瘤坏死因子受体相关因子(tumor necrosis factor receptor associated factor, TRAFs)就是该通路中重要调节蛋白之一。TRAFs是胞内接头蛋白,作为NF-kB信号传导通路上游的接头分子,参与调控细胞增殖、分化以及凋亡等。已证实TRAF2,TRAF5及TRAF6参与NF-κB经典通路的活化。为进一步研究NF-kB信号通路的调节机制,我们在前期工作中用酵母双杂交技术,以TRAF2为诱饵质粒从成人的肝文库筛选其相互作用蛋白,发现细胞周期相关因子3(Cell division cycle associated protein3,CDCA3)可能与TRAF2存在相互作用。CDCA3是F box蛋白,是细胞有丝分裂过程中所必需的胞质蛋白。它通过与S期激酶相关蛋白1(S-phase kinase-associatedprotein1,SKP1)、淘汰素(cullin-1)共同参与E3连接酶复合物的构成,与有丝分裂抑制激酶、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员Wee1的泛素化和降解有关,是细胞进入有丝分裂的触发器,且是细胞周期蛋白依赖激酶1(cdk1)/细胞周期蛋白B(cyclin B)的适当激活和细胞进入有丝分裂必需的。因此 CDCA3与TRAF2的相互作用可能具有重要意义。
　　为进一步确认CDCA3与TRAF2的相互作用,探讨其对NF-kB途径的影响,展开以下实验。首先利用荧光素酶报告基因实验,证明了人胚胎肾293(HEK293)细胞中过表达CDCA3,能够抑制NF-κB的转录活性,对不同细胞因子刺激的NF-κB转录激活有抑制作用;在 NF-κB经典通路中CDCA3能够抑制TRAF2及其家族成员TRAF5,TRAF6介导的NF-κB转录活性;CDCA3也协同TRAF1,TRAF3抑制NF-κB;CDCA3会抑制RIP,MYD88,IKKα,IKKβ及p65对NF-κB的激活,用TNFα刺激后,CDCA3仍能够负调控NF-κB的转录激活;这些抑制效应有剂量依赖效应,这些实验结果提示CDCA3能够负调控NF-κB的转录活性。为进一步在 HEK293细胞中检测CDCA3功能及作用机制,构建了CDCA3 shRNA干涉载体,进行了RNA干扰(RNA interference,RNAi)实验,敲低CDCA3后,检测了NF-κB的转录活性情况,证实CDCA3敲低后NF-κB活性增高。为研究CDCA3负调控NF-kB的机制,用外源性免疫共沉淀实验确认TRAF2和CDCA3存在相互作用。同时用酵母双杂交技术初步筛选出CDCA3与TRAF1,TRAF2都有相互作用。随后用免疫共沉淀实验分析了CDCA3与TRAFs家族相互作用的特异性,发现CDCA3分别与TRAF1,TRAF2,TRAF5,TRAF6,甚至IκBα均有相互作用,而与p65和NEMO没有相互作用。提示CDCA3负调控NF-κB的机制是很复杂的,有可能是通过TRAF1,TRAF2及IκBα这些靶点来实现调控作用的。
　　综上所述,本研究初步揭示了CDCA3负调控NF-κB信号通路,可能通过与TRAF1,TRAF2以及IκBα发生相互作用,发挥转录抑制活性,并且抑制相关靶基因的表达。CDCA3对NF-κB信号通路的负调控作用可能在肿瘤细胞的增生、凋亡过程中具有重要生理意义。

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英文缩略语

中文摘要

英文摘要

主要仪器设备和常用试剂的配制

一、 主要仪器设备

二、常用溶液的配制

1 前言

2材料与方法

2. 1实验材料

2.2 实验方法

3 结果

3.1分子克隆的结果

3.2 对经典通路中NF-κB转录活性的影响

3.3 CDCA3 shRNA干涉载体的构建及对经典通路中NF-κB转录活性的影响

3.4 免疫共沉淀（co-IP）验证CDCA3 与TRAF2的相互作用

3.5 酵母双杂交验证CDCA3与TRAFs家族成员相互作用

3.6 免疫共沉淀验证CDCA3与TRAF1, 2, 5, 6均有相互作用

3.7 免疫共沉淀验证CDCA3与NF-κB通路相关分子的相互作用

4.讨论

全文总结

参考文献

附录1目的基因PCR扩增和鉴定引物

附录 2 个人简历

致谢

综述