GRIM-19与E6和E6AP的蛋白相互作用及作用位点的研究

摘要

研究背景:
　　子宫颈癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤中最常见的恶性肿瘤,严重威胁着女性的健康和生命。全世界每年大约有50万新发子宫颈癌病例,约23万女性死于子宫颈癌,其中大部分(80％左右)发生在发展中国家。其中发病率最高的是南非,其次是亚洲。我国每年新发病例约13万例,占全世界的近1/4。子宫颈癌的病因迄今未完全明确。分子生物学研究表明90%以上的子宫颈癌伴有高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)感染,主要是16、18亚型。高危型HPV持续感染在子宫颈癌的发生和发展中起着至关重要的作用,70%以上的子宫颈癌组织中存在HR-HPV基因组的整合。
　　目前的研究证实,高危型HPV16和18型的早期基因E6、E7编码的早期蛋白E6、E7在宫颈上皮细胞恶化过程中发挥关键作用。E6、E7蛋白分别于P53和Rb结合,使P53和Rb降解,最终导致子宫颈癌的发生。E6蛋白的致癌作用主要表现在招募E6AP(E6-associated protein)形成复合体后与P53核心区结合,促进P53通过泛素蛋白酶体降解途径降解。E6AP是泛素连接酶(ubiquitin-ligase enzyme,E3)的HECT结构域家族成员。HPV E6蛋白与E6AP结合后将活化的泛素转移到P53蛋白上,最终P53蛋白在26S蛋白酶体的作用下沿泛素化降解途径降解。在子宫颈癌的发生和发展中,E6对P53的抑制和降解作用起着关键作用。
　　GRIMs(genes associated with retinoid-IFN-inducedmortality)是近年来发现的一群参与干扰素(interferon,IFN)和维甲酸(retinoic acid,RA)合并诱导的细胞凋亡基因,是Kalvakolanu用反义 RNA敲除技术在乳腺癌细胞中筛选鉴定并首先报道的凋亡蛋白。GRIM-19属GRIMs家族成员,定位于19 p13.2,是参与细胞线粒体的呼吸作用和调控细胞凋亡的新基因。GRIM-19主要定位在线粒体,细胞核也有少量表达,在人体多种正常组织中均有其表达。研究发现GRIM-19的表达促进了细胞的凋亡,其表达降低或位点突变可以导致细胞的异常增殖和恶性转化。许多肿瘤中,如甲状腺肿瘤、口腔癌、肾癌、结直肠癌等中均发现GRIM-19表达的降低。但GRIM-19在子宫颈癌细胞发生、发展中所发挥的具体作用尚不明晰。
　　本课题组前期试验已证实在子宫颈癌细胞株HeLa、SiHa和CaSki细胞中均发现GRIM-19可以上调p53及其下游基因p21、PUMA的表达,而HPV阴性的卵巢癌细胞株H08910细胞中却并未发现该现象。GRIM-19具有诱导子宫颈癌细胞中 P53蛋白积聚的重要作用且积聚的P53蛋白具有抑制子宫颈癌细胞增殖的功能。而且证实GRIM-19诱导子宫颈癌细胞中P53蛋白的积聚作用既不是直接作用也不是通过抑制STAT3而间接促进P53基因的转录、翻译,而是通过抑制子宫颈癌细胞中P53蛋白的降解,延长其半衰期来达到诱导 P53蛋白积聚的作用。子宫颈癌细胞中P53蛋白的降解是通过E6和E6AP的共同作用来实现的。本实验组前期以HPV18E6为研究对象,进一步研究了子宫颈癌细胞中GRIM-19与HPV18E6的相互作用,结果显示:GRIM-19与18E6具有蛋白结合作用,而与p53没有蛋白结合作用;GRIM-19诱导HR-HPV感染的子宫颈癌细胞中p53蛋白积聚的作用机制是通过与E6蛋白结合,阻碍E6介导的p53泛素化降解途径;E6AP具有竞争18E6结合GRIM-19的作用。本实验将以HPV16E6、HPV18E6为研究对象,进一步探讨子宫颈癌细胞中GRIM-19与HPV16E6、HPV18E6的相互作用及其作用位点。
　　目的:
　　研究子宫颈癌细胞中GRIM-19与HPV16E6、HPV18E6的相互作用及其作用位点的研究,为子宫颈癌的生物治疗提供新的理论依据和治疗线索。
　　方法:
　　(1)构建GRIM-19,HPV16E6原核表达载体:pGST-G19①[pGEX-4T-3-GRIM-19(1-35)]、pGST-G19②[pGEX-4T-3-GRIM-19(36-70)]、pGST-G19③[pGEX-4T-3-GRIM-19(71-144)]、pET-flag-16E6(pET-22b-3×flag-16E6),16E6真核表达质粒:p3×Flag-16E6(p3×Flag-CMV-Myc-24-16E6);(2)采用免疫共沉淀方法(CO-IP)检测GRIM-19与16E6蛋白的体内结合作用;(3)诱导融合蛋白在大肠杆菌中表达与纯化;(4)采用GST pull down方法检测GRIM-19与16E6、18E6蛋白的体外结合作用;(5)采用GST pull down方法检测GRIM-19与E6AP蛋白的体外结合作用。
　　结果:
　　(1)CO-IP方法检测结果显示在宫颈癌细胞株SiHa细胞中GRIM-19与16E6在体内具有蛋白结合作用(2)GST pull down方法检测结果显示GRIM-19①与HPV16E6在体外具有蛋白结合作用;(3)GST pull down方法检测结果显示GRIM-19①与HPV18E6在体外具有蛋白结合作用;(4)GST pull down方法检测结果显示GRIM-19与E6AP①在体外具没有蛋白结合作用;(5)GST pull down方法检测结果显示GRIM-19与E6AP②在体外具没有蛋白结合作用;(6)GST pull down方法检测结果显示GRIM-19与E6AP③在体外具有蛋白结合作用;(7)GST pull down方法检测结果显示GRIM-19①与E6AP③在体外具有蛋白结合作用。
　　结论:
　　GRIM-19与HPV16E6、HPV18E6均有结合作用且GRIM-19的结合位点均为第1-35位氨基酸;GRIM-19与E6AP在体外有结合作用,GRIM-19的结合位点为第1-35位氨基酸,E6AP的结合位点为第521-872位氨基酸即HECT结构域。

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英文缩略表（abbreviations）

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前言

2 材料和方法

2.1材料

2.2 方 法

2.3 统计数据处理

3 结果

3.1 CO-IP实验检测GRIM-19与16E6的蛋白结合作用

3.2 融合蛋白在大肠杆菌中的诱导表达与纯化

3.3 GST pull down实验检测GRIM-19及其截断体与18E6、16E6、E6AP的蛋白结合作用

4 讨论

4.1 GRIM-19可以提高子宫颈癌细胞中的P53蛋白聚集

4.2 GRIM-19与HR-HPV E6有蛋白结合作用

4.4 结语与展望

5 结论

参考文献

附录

致谢

综述