药物难治性癫痫耐药机制中PGP和MRP1作用的研究

摘要

药物难治性癫痫耐药机制中PGP和MRP1作用的研究 研究背景： 在过去的20年中，尽管不断有新的抗癫痫药(antieoilepticdrugs，AEDs)投入临床应用，但仍有30％左右的癫痫患者对AEDs不敏感，出现难以被控制的反复发作，临床上称之为难治性癫痫。难治性癫痫的预后不佳，有较高的致残和致死率。因此研究难治性癫痫对ADs产生耐药的原因，发现新的治疗措施，具有重要意义。在肿瘤化疗的过程中发现，长期接触某一种化疗药物产生的不仅对此种化疗药物耐药，而且可对其他结构和功能不同的多种化疗药物产生交叉耐药性的现象，此被称为多药耐药(multidrugresistance.,MDR。研究表明肿瘤细胞膜上表达的多药转运体，能够将化疗药物泵出细胞外，减少了肿瘤细胞内的药物浓度，参与了肿瘤耐药的发生。同样情况也出现在难治性癫痫上，通常如果患者对一种AD耐受，他往往也对其它的AEDs不敏感。研究发现难治性癫痫耐药和肿瘤耐药之间存在相同的病理机制。目前研究认为在生理条件下人体血脑屏障(blood-brainbarrier,BBB)毛细血管内皮细胞和胶质细胞上就有多药转运体的表达，而在难治性癫痫患者病灶切除的标本发现血脑屏障上有高表达的多药转运体。进一步对其功能的研究发现，多药转运体是一类ATP结合蛋白质超家族，能够识别多种作用机制不同的AEDs，主动将药物泵出到血脑屏障以外。因此认为，难治性癫痫患者脑内多药转运体表达增高，引起ADs通过血脑屏障障碍，患者脑内ADs浓度下降，可能参与了难治性癫痫多药耐药的发生。P．糖蛋白(P-glycoprotein,PGP)和多药耐药相关蛋白1(multi-drugresistanceassociatedprotein,MRP1)是被人们研究最早的两种多药转运体。本课题通过观察难治性癫痫患者和模型大鼠脑内PGP、MRP1的表达和分布；采用PGP、MRP1特异性拮抗剂维拉帕米(verapamil，Ver)和丙磺舒(probenecid，Pro)观察PGP和MRPl对苯妥英钠(phenytoin,PHT)和卡马西平(carbamazepine,CBZ)通过癫痫大鼠血脑屏障的影响；PGP对体外培养的耐药细胞内PHT和CBZ浓度的影响以及PGP对慢性杏仁核点燃模型大鼠电生理和行为的影响。在形态和功能不同角度研究PGP、MRPl在难治性癫痫多药耐药机制中的作用。 材料与方法： 本文共分四部分：第一部分建立慢性杏仁核点燃癫痫动物模型，采用RT-PCR、免疫组化和Westerm-blot的方法，观察难治性癫痫患者和模型大鼠脑内PGP、MRPlmRNA和蛋白的表达。第二部分采用微透析技术和高效液相色谱技术，通过腹腔注射PHT和CBz，观察在癫痫和正常大鼠皮层细胞外液AEDs的浓度差异；观察脑内局部给予PGP拮抗剂Ver和MRPl拮抗剂Pro后，癫痫大鼠皮层细胞外液中AEDs的浓度变化。第三部分建立PGP高表达的K562/Dox耐药细胞株，比较耐药细胞株和PGP表达阴性的K562细胞株对PHT和CBZ的摄取：观察给予Ver后，耐药细胞内AEDs的浓度变化。第四部分在杏仁核电点燃模型上，观察Ver对耐PHT和CBZ大鼠的后放电阈值(afterdischargethreshold,ADT)、后放电时程(afterdischargeduration.ADD)等电生理指标和行为学的影响。结果： 第一部分实验结果：L与对照组相比，难治性癫痫患者和大鼠脑内皮层和海马PGPmRNA和蛋白表达显著增高(P＜O.05)。2．与对照组相比，难治性癫痫大鼠脑内皮层和海马MRPlmRNA和蛋白表达显著增高(P

目录

英文缩写词表

前言

库错第一节PGP在难治性癫痫患者及慢性杏仁核点燃癫痫动物模型脑内的表达

第一部分：PGP和MRP1在难治性癫痫患者及动物模型脑内的表达：第二节MRP1在难治性癫痫患者及慢性杏仁核点燃癫痫动物模型脑内的表达

第一部分：PGP和MRP1在难治性癫痫患者及动物模型脑内的表达：第一部分小结

第二部分：PGP和MRP1对癫痫大鼠皮层细胞外液抗癫痫药物浓度的影响：第一节PGP对癫痫大鼠皮层细胞外液抗癫痫药物浓度的影响

第二部分：PGP和MRP1对癫痫大鼠皮层细胞外液抗癫痫药物浓度的影响：第二节MRP1对癫痫大鼠皮层细胞外液抗癫痫药物浓度的影响

第二部分：PGP和MRP1对癫痫大鼠皮层细胞外液抗癫痫药物浓度的影响：第二部分小结

第三部分：PGP对体外培养的细胞内AEDs浓度的影响：引言

第三部分：PGP对体外培养的细胞内AEDs浓度的影响：材料和方法

第三部分：PGP对体外培养的细胞内AEDs浓度的影响：结果

第三部分：PGP对体外培养的细胞内AEDs浓度的影响：讨论

第三部分：PGP对体外培养的细胞内AEDs浓度的影响：第三部分小节

第四部分：PGP对慢性杏仁核点燃大鼠模型电生理和行为的影响：引言

第四部分：PGP对慢性杏仁核点燃大鼠模型电生理和行为的影响：材料和方法

第四部分：PGP对慢性杏仁核点燃大鼠模型电生理和行为的影响：结果

第四部分：PGP对慢性杏仁核点燃大鼠模型电生理和行为的影响：讨论

第四部分：PGP对慢性杏仁核点燃大鼠模型电生理和行为的影响：第四部分小结

全文参考文献

致谢

附录一：论文发表情况

附录二：难治性癫痫耐药机制的研究进展

论文独创性声明及论文使用授权声明