声明
符号说明
第1章绪论
1.1 纤毛简介
1.1.1 初级纤毛的结构
1.1.2 纤毛的发生
1.1.3 初级纤毛内的物质运输
1.1.4初级纤毛的解聚
1.1.5 初级纤毛的功能
1.2 Hedgehog信号通路简介
1.2.1 Hedgehog基因的发现
1.2.2 Hh信号传导的分子机制
1.3 初级纤毛与Hedgehog信号通路的关系
1.3.1 Hh信号通路关键蛋白定位于初级纤毛上
1.3.2 初级纤毛发生的异常导致Hh信号通路传导受阻
1.4 Rab蛋白对纤毛囊泡运输的作用
1.4.1 Rab8和Rab11对纤毛蛋白的运输调控
1.4.2 Rab23对纤毛囊泡运输的影响
1.4.3 Rab34简介
1.5纤毛病变
1.5.1 Bardet-Biedl综合征（BBS）
1.5.2 Joubert综合征
1.5.3 Meckel综合征 （MKS）
1.5.4Ellis-van Creveld综合征（EVC）
1.5.5 囊性肾脏（PKD）
1.5.6 JATD综合征
1.5.7 Oro-Facial-Digital综合征（OFD）
1.5.8Cranioectodermal Dysplasia综合征（CED）
1.6 本论文的研究内容和意义
参考文献
第2章实验材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1质粒载体
2.1.2菌种
2.1.3细胞系
2.1.4 试剂和仪器
2.1.5 主要试剂的配制
2.2 实验方法
2.2.1 质粒抽提
2.2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备
2.2.3 基因克隆技术
2.2.4 Gateway克隆 LR重组反应
2.2.5 蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
2.2.6蛋白质印迹法（Western Blotting）
2.2.7 免疫沉淀（Immunoprecipitation）
2.2.8 利用LAP系统的免疫亲和纯化实验
2.2.9 传代细胞培养
2.2.10 磷酸钙介导的慢病毒包装及感染细胞实验技术
2.2.11 利用Crispr-cas9质粒建立敲除细胞系
2.2.12 PolyJet体外DNA转染法
2.2.13 单层细胞的免疫荧光染色
2.2.14 基因打靶技术构建突变小鼠
2.2.15 PCR鉴定小鼠或小鼠胚胎基因型
2.2.16 小鼠 MEFs细胞的制备
2.2.17 冷冻切片的制备
2.2.18 冷冻切片免疫荧光染色
2.2.19 逆转录定量PCR技术（RT-qPCR）
第3章Rab34基因缺失影响纤毛的形成
3.1 研究背景
3.2 材料与方法
3.2.1 利用Crispr-cas9技术构建Rab34基因敲除克隆载体
3.2.2 cDNA质粒的扩增以及过表达克隆载体的构建
3.2.3 重组Lentivirus的包装、转染，及感染细胞
3.2.4 稳定细胞系的构建与培养
3.2.5 抗体
3.2.6 单层细胞免疫荧光染色
3.2.7 Rab34-/-基因突变小鼠的构建
3.2.8 胚胎冷冻切片制备
3.2.9 冷冻切片免疫荧光染色
3.3 结果
3.3.1 体外培养的细胞中Rab34的缺失导致纤毛发生显著减少
3.3.2 Rab34突变细胞过表达FS-Rab34CR能够招募纤毛发生
3.3.3 Rab34是体内纤毛形成所必需的 基因
3.4 讨论
参考文献
第4章Rab34在Hh信号通路传导中的功能研究
4.1 研究背景
4.2 材料与方法
4.2.1 抗体
4.2.2 Rab34-/-基因突变小鼠胚胎的表型分析
4.2.3蛋白质免疫印迹（Western blotting）
4.2.4逆转录定量PCR法
4.2.5 原代小鼠胚胎成纤维细胞（pMEFs）的制备和培养
4.2.6 胚胎冷冻切片制备
4.2.7 胚胎冷冻切片的免疫荧光染色
4.3 结果
4.3.1 Rab34-/-基因突变小鼠胚胎的表型分析
4.3.2 Rab34-/-基因突变小鼠中Gli3的加工和Gli2的功能受到影响
4.3.3 Rab34损失影响Patch1和Gli1的表达水平
4.3.4 Rab34-/-细胞中Smo和Gli2的表达水平受SAG影响
4.3.5 Rab34的RNA表达水平不受SAG影响
4.3.6 Rab34-/-基因突变小鼠胚胎神经管的模式发育
4.4 讨论
参考文献
第5章Rab34蛋白在纤毛囊泡形成中的作用研究
5.1 研究背景
5.2 材料与方法
5.2.1 LAP-Rab34及其突变体克隆的构建
5.2.2 cDNA的扩增以及过表达克隆载体的构建
5.2.3 重组Lentivirus的包装、转染，及感染细胞
5.2.4 稳定细胞系的构建和细胞培养
5.2.5 Lentivirus瞬时感染 (Transient infection) NIH3T3细胞
5.2.6 PolyJet体外DNA转染法
5.2.7 pMEFs小鼠原代胚胎成纤维细胞的获取
5.2.8 抗体
5.2.9 单层细胞免疫荧光染色
5.2.10蛋白质免疫印迹(Western blotting)
5.2.11 免疫沉淀(Immunoprecipitation)
5.2.12 E10.5小鼠胚胎的包埋制样
5.2.13 透射电子显微镜(TEM)
5.3 结果
5.3.1 重组克隆的构建及鉴定
5.3.2 Rab34蛋白定位于高尔基体
5.3.3 LAP-Rab34定位于纤毛
5.3.4 Rab34结合GDP及GTP的两种形式与纤毛发生
5.3.5 Rab8，Rab11和Rabin8的亚细胞定位独立于Rab34
5.3.6 BBS4和IFT20分别独立于Rab34
5.3.7 Ehd1在基体的定位受Rab34的影响
5.3.8 Cp110在中心粒的表达不受Rab34影响
5.3.9 Cep164和Ofd1等中心粒蛋白的表达和定位独立于Rab34
5.3.10 Rab34缺失阻碍前体纤毛囊泡连续融合形成纤毛囊泡
5.4 讨论
参考文献
第6章结论与展望
6.1 结论
6.1.1 Rab34基因的缺失影响体外及小鼠体内纤毛的形成
6.1.2 Rab34突变抑制Hedgehog信号通路传导及肢体模式形成
6.1.3 Rab34基因突变阻碍前体纤毛囊泡融合形成纤毛囊泡
6.2 展望
附录
博士期间发表论文、奖励和参加科研情况
致谢
东华大学;
