一株嗜酸性霉菌的鉴定及其α-淀粉酶和甘露聚糖酶基因的克隆与表达

摘要

黑曲霉是一种重要的工业发酵菌，生长迅速，发酵周期短，且生长过程中不受杂菌的污染及不产毒素的特点，为符合美国 FDA之GRAS 公认安全菌株，产酶种类多，产酶能力强，一些极端酶大部分来自于曲霉，由此更加奠定了其在发酵工业上的地位。　　耐酸性α-淀粉酶可补足常用淀粉酶在低pH条件下性能不足的短板，在提高工业生产废品的利用和处理、降低原料消耗等方面具有很大的应用潜力与开发前景，甘露聚糖酶是一种新型的工业化生产酶，但是由于其发酵酶活低而导致其成本高，限制了应用范围，因此，对该酶的研究具有一定的价值。　　本实验从新疆某铀矿酸性浸出液分离得到一株霉菌，本实验中命名为MJ 5。根据形态学特征、rDNA ITS序列分析以及Biolog鉴定系统对该菌株进行鉴定，同时Biolog鉴定板可提供菌株对碳源的消耗情况，由此可分析了解该菌的生长情况及优势碳源。通过对菌株的粗酶液测定α淀粉酶酶活，根据全基因组测序结果，设计引物获得耐酸性α淀粉酶和甘露聚糖酶基因的序列片段，与pPIC9K构建表达载体，导入酵母受体细胞进行表达，结果表明：　　（1）结合三种鉴定系统鉴定霉菌MJ5为黑曲霉Aspergillus niger，霉菌的最适碳源为p-羟苯乙酸，在8大类碳源中对氨基酸类、脂类、酸类的利用率较高，由其所产的粗酶液酶学性质研究可知该菌产酸性淀粉酶，酶催化反应的最适pH和温度为5.0和45℃，相同温度不同pH的条件下保温反应1h，MJ 5淀粉酶的酶活性在pH3-7范围内仍保持在80%以上，在pH相同温度不同的环境下进行保温反应1h，MJ 5淀粉酶在40℃、45℃、50℃以及55℃酶活性还剩余70%以上，由此可说明MJ 5的淀粉酶具有较好的pH稳定性和热稳定性。　　（2）根据黑曲霉全基因组测序结果对耐酸性 α-淀粉酶基因序列设计合适引物，运用PCR扩增法从真菌Aspergillus nigerMJ 5中得到属于糖苷水解酶第13家族（GH13）的耐酸性α-淀粉酶基因α-amy-5片段，将基因片段连接载体pPIC9K导入大肠杆菌TransI-T1中进行克隆，挑取阳性克隆测序，由结果可知：α-淀粉酶基因总长为1650 bp，N端前28个氨基酸为信号肽序列，去除信号肽序列后该基因长度为1566 bp，编码521个氨基酸和一个终止密码子，将重组质粒pPIC9K-α-amy-5线性化并电击转入毕赤酵母表达，但是没有检测到重组酶酶活，具体原因尚待分析。　　（3）从Aspergillus nigerMJ 5中克隆得到的甘露聚糖酶基因man-5片段，全长为1008 bp，BlastP显示该酶为糖苷水解酶第26家族，除去信号肽序列后DNA片段与cDNA片段长度为954 bp，编码317个氨基酸和一个终止密码子，由生物信息学分析可以知道该段氨基酸序列有4 个可被糖基化位点，并且等电点和分子量分别预测为 5.71和37 KDa，通过酶学性质测定可知该段基因的最适温度和最适pH为35℃和pH 5.0，在不同缓冲液下，37℃反应1 h，在pH 5.0-pH 7.0之间还残余80%的酶活，对pH耐受范围不广，在40℃反应1h，酶活几乎没有损失，但是随着温度的提高，甘露聚糖酶几乎失活， K+、β-巯基乙醇、Na+、Pb2+、Mg2+和 EDTA可以提高甘露聚糖酶的酶活，Cr3+、Mn2+、Cu2+和Ca2+则对酶活有抑制作用，其中β-巯基乙醇对酶活的提高能力最强，Fe3+对Man-5酶活的提高不受浓度的影响，其他离子及试剂对酶活几乎没有影响，由此可知金属离子及化学试剂对MJ 5所产的甘露聚糖酶影响不大，纯化后的Man-5的蛋白含量为8.57 mg/mL，酶活为864 U/mL，最后得出比活为101 U/mg，动力学测定得出Man-5的Km和Vmax分别为1.9 mg/mL，1638 μmol/min·mg。

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第一章 前言

1.1黑曲霉

1.2 耐酸性α-淀粉酶

1.3 甘露聚糖酶