热处理、UVB辐射后HSP72和P53的变化对黑素细胞功能影响的实验研究

摘要

目的:通过检测人表皮黑素细胞在热处理、UVB辐射及二者联合作用后HSP72、P53蛋白与基因表达的变化,初步分析热处理及二者联合作用后黑素细胞功能变化的可能机制,为热治疗白癜风及热联合UVB治疗白癜风提供理论依据。
　　方法:(1)黑素细胞原代及传代培养:取新鲜的包皮环切标本,逐步进行组织及细胞分离,经过黑素细胞专用培养基培养2代后获得纯化的黑素细胞。(2)选取3-5代细胞生长至60％-70%融合时,对细胞进行热处理(42℃每天干预1h,连续干预3d),分别在末次处理后4h,6h,24h采用Western印迹技术观察HSP72蛋白的表达及变化趋势;末次处理后6h,12h,24h观察P53蛋白的表达及变化趋势。选取后续实验收集细胞的最佳时间点。(3)将细胞随机分为对照组,热处理组(42℃每天干预1h,连续干预3d),UVB辐射组(50mj/㎝2辐射剂量,连续干预3d),联合作用组(首先42℃干预1h,然后50mj/㎝2UVB辐射,连续3d)。(4)根据(2)中得到的蛋白表达的最佳时间点,采用Western印迹和RT-PCR技术分别检测不同组别间HSP72和P53的表达变化。(5)Western印迹结果采用GeneTools进行灰度值分析。HSP72相对表达量以目的蛋白条带与β-肌动蛋白条带的灰度值之比表示。RT-PCR结果采用2-ΔΔCt法表示,即目的基因相对于对照组基因所改变的倍数,使目的基因归一化,减少由于抽提RNA得率的差异和细胞数引起的误差。实验数据采用Spss13.0进行分析。
　　结果:(1)HSP72蛋白在热处理后4h已出现增多6h达到高峰,24h仍有表达,但水平下降;P53蛋白在热处理后6h到24h内呈持续增多趋势。(2)不同组别间HSP72蛋白和mRAN的表达变化:Western印迹结果显示,热处理组(2.022±0.058)及联合作用组(2.080±0.045)HSP72蛋白表达水平明显高于对照组(0.532±0.033,P<0.001);UVB组(0.546±0.021)与对照组相比表达水平无明显差异(P>0.05);RT-PCR技术显示,热处理组(6.769±0.895)及联合作用组(7.474±0.467)与对照组(1.000)相比,mRNA表达水平明显增加(P<0.001);UVB辐射组(0.856±0.086)与对照组相比,mRNA表达水平无明显差异(P>0.05)。析因设计方差分析结果显示热处理与UVB辐射对HSP72蛋白和mRNA表达均无交互作用(F=1.399,2.109,P>0.05)。(3)不同组别间P53蛋白和mRNA的表达变化:Western印迹结果显示热处理组(0.512±0.016)和UVB辐射组(0.554±0.021)P53蛋白表达水平高于对照组(0.316±0.024,P<0.001),联合作用组(0.850±0.020)表达高于单因素处理组;RT-PCR技术显示,热处理组(0.755±0.045),UVB辐射组(0.812±0.186)与对照组(1.000)相比mRNA表达无明显差异(P>0.05),联合作用组mRNA表达(1.173±0.106)上调;析因设计方差分析结果显示热处理与UVB辐射对P53蛋白及mRNA表达有交互作用(F值分别为29.762,23.048,P<0.05)。
　　结论:
　　(1)热处理可以引起HSP72和P53蛋白表达增多,分别在末次处理后6h,24h较为显著。
　　(2)热处理组和联合作用组可以引起HSP72蛋白和mRNA表达显著增多,且两组间表达水平类似。UVB辐射后HSP72蛋白和mRNA表达均未增多,所以HSP72表达是热激发的。根据HSP72的作用提示HSP72可能与热处理引起黑素细胞增殖活性增强及UVB辐射后的损伤保护作用有关。
　　(3)热处理组、UVB辐射组及联合作用组与对照组相比P53蛋白表达水平增高,热处理和UVB辐射对P53蛋白表达上调具有协同作用;热处理组、UVB辐射组与对照组相比P53mRNA表达水平未见明显变化,说明单纯热处理或UVB辐射引起P53蛋白上调是转录后水平发生变化,热与UVB联合可以协同使P53mRNA上调。基于P53在黑素形成中的作用,推测热处理后黑素细胞黑素合成增多与UVB类似也是通过P53通路调控的。

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英文摘要

1 引言

2 材料与方法

2.1材料

2.2方法

3 结果

3.1 Western 印迹技术检测热处理后不同时间点HSP72和P53的表达

3.2 Western 印迹技术检测对照组、UVB 辐射组、热处理组及联合作用组 HSP72 和P53表达的差异(图2，表1)

3.3 RT-PCR检测对照组、UVB辐射组、热处理组联合作用组HSP72mRNA和P53mRNA表达的差异（图3，4，5，表2）

4 讨论

5 结论

参考文献

附录个人简历

致谢

综述

1. P53 的结构与主要功能

2. P53与黑色素形成

3. P53与黑色素瘤

4.结语