SIRT1在慢性不可预知应激致小鼠抑郁样行为改变中的作用

摘要

抑郁症是一种常见的精神、心理疾病，严重影响患者的正常生活和身心健康，也给患者家庭带来沉重负担。炎症反应可能是抑郁发病的重要影响因素，但炎症反应的变化机制并不明确。因此，探索SIRT1与抑郁症的关系，炎症和抑郁症的关系，以及SIRT1如何调控应激性炎症反应，对于抑郁症的研究进展有重要意义。　　实验目的：　　本研究通过慢性不可预知应激建立BABL/c小鼠抑郁模型，并利用SIRT1的激活剂白藜芦醇干预抑郁小鼠，观察应激小鼠脑组织中SIRT1表达与抑郁样行为之间的关系，并初步检测SIRT1调控的信号通路的变化。最后，在细胞水平进一步验证SIRT1对BV2小胶质细胞炎症反应的调控及相关机制，希望能为抑郁症的机制研究及临床治疗提供一定的实验依据。　　实验方法：　　1、建立小鼠抑郁模型　　2、小鼠行为学指标的测定　　(1)糖水偏爱实验(Sucrose preference test)　　在糖水适应阶段，每笼小鼠分别放两个1％(w/v)的蔗糖水瓶。每隔7天晚上固定时间(21:00～22:00)做糖水偏爱实验。每只小鼠单独放在一个鼠笼，一瓶自来水，一瓶蔗糖水，测定在1h时间内喝水量。统计小鼠的糖水偏爱分数:糖水/（糖水+自来水）×100％。　　(2)自发活动(Spontaneous Activities)　　把小鼠放在自发活动仪器暗箱底部中间位置，箱项安装摄像装置，记录小鼠在5min内的运动情况，通过Ethovision XT软件处理记录的运动图像，分析小鼠运动的平均速度。　　(3)悬尾实验(TST)　　用医用胶带将小鼠尾尖固定在测试箱的重力传感器上，正式实验开始前先观察一只小鼠处于不动状态时的数值，该数值设为阈值，并记录小鼠在6min内的不动时间，取后5min内的不动时间统计分析。　　3、免疫荧光标记　　先将石蜡切片脱蜡冲洗，用EDTA缓冲液修复，3％过氧化氢溶液孵育10min后，用5％BSA封闭20min，封闭结束后加入50μl稀释的SIRT1抗体(1:2000)、Iba-1抗体(1:2000)，抗体孵育过夜。24h后二抗避光孵育1h后，每张切片加50-100μL DAPI，避光染核5min，稍后用封片剂封片，放在4℃保存，注意避光。　　4、小鼠脑组织尼氏染色　　用4％的多聚甲醛将小鼠脑组织固定，包埋石蜡，切片(4μm)，将切片的组织浸泡在1％的甲苯胺蓝中，50C染色20min，之后用双蒸水冲洗干净并固定，用荧光显微镜观察切片并采集图像。　　5、细胞的培养及干预　　小鼠BV2细胞株，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基培养。待细胞生长状态较好时，将细胞传代至六孔板中，按照一定的时间顺序分别用IFNγ、 Res、NAM干预细胞。干预结束后收集细胞和细胞培养基备用。　　6、ELISA测小鼠血浆及细胞培养基中细胞因子　　收集小鼠血浆和细胞培养基上清，根据affymetrix eBioscience ELISA试剂盒说明书操作，检测小鼠血浆和细胞培养基上清中TNF-α和IFNγ的浓度。　　7、Western-blot　　用RIPA裂解液提取脑组织和细胞的总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度，100℃10min完成蛋白变性。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳1.5h，转膜1.5h，封闭2h，孵育一抗过夜，漂洗8min3次，孵育二抗1.5h，漂洗8min3次后，显影，条带采用ImageJ图像分析软件进行灰度分析。　　8、统计方法　　使用SPSS16.0软件进行统计分析，Excel2007和graphPad整理数据和绘制图表，用ImageJ软件分析Western条带灰度值。统计方法为两独立样本t-检验，结果以P＜0.05为显著性水平，P＜0.01为非常显著性水平。　　实验结果：　　1、应激35D成功建立小鼠抑郁模型　　(1)应激对小鼠行为的影响　　慢性不可预知应激35天后，与Con组比较，Stress组小鼠出现行为学变化，三个行为学指标差异均具有统计学意义。糖水偏爱实验(Sucrose preference test)中，Stress组糖水偏爱分数显著低于Con组（P＜0.01）;悬尾实验(TST)中，与Con组比较，Stress组5min内不动时间延长（P＜0.05）;自发活动实验(Spontaneous activity)中，5min内Stress组小鼠运动平均速度下降(P＜0.05)。　　(2)应激对小鼠体重的影响　　结果表明，慢性不可预知应激35天后，与Con组比较，Stress组小鼠体重降低，且差异具有统计学意义(P＜0.05)。慢性不可预知应激5周后，与Con组比较，Stress组小鼠附睾周围脂肪与体重的比值下降，且差异有统计学意义（P＜0.05）。　　2、激活SIRT1的表达改善应激小鼠抑郁样行为和炎症水平　　(1)激活SIRT1对小鼠抑郁样行为的影响　　从应激第3周开始，每天给予小鼠25mg/kg剂量Res，应激35天时抑郁小鼠的行为学指标（糖水偏爱实验、自发活动实验和悬尾实验）得到改善，恢复到对照组水平。　　(2) Res对应激小鼠前额皮质及海马中SIRT1、AMPK、GSK3β蛋白表达的影响　　与Con组相比，应激35天小鼠前额皮质和海马中的SIRT1、p-SIRT1、AMPK、p-AMPK表达显著下降，GSK3β表达升高。与Stress组相比，Stress+Res组SIRT1、p-SIRT1、AMPK、p-AMPK表达升高，GSK3β表达下降，恢复到对照组水平。　　(3) Res对应激小鼠脑组织小胶质细胞中SIRT1的影响　　应激35天后，小鼠脑组织中的小胶质细胞数量显著增加，说明慢性应激会激活小胶质细胞。同时应激组神经元中SIRT1含量下降，而给予Res可以抑制SIRT1的下降。Iba-1与SIRT1双标结果显示，Stress组小胶质细胞中SIRT1含量下降。Stress+Res组小胶质细胞中的SIRT1恢复到正常水平，提示小鼠抑郁样行为的改善可能与激活SIRT1的表达相关。　　(4)激活SIRT1对应激小鼠脑组织形态学的影响　　尼氏染色结果显示，尼氏小体呈三角形或椭圆型块状，颜色为紫蓝色。慢性不可预知应激使皮层和海马CA3区神经元尼氏小体显著减少，细胞壁变薄，说明慢性不可预知应激引起了神经元的损伤。同时染色结果显示，Stress+Res组小鼠前额皮质和海马中的尼氏小体恢复到对照组数量和状态。　　(5)激活SIRT1对应激小鼠血浆中TNF-α、IFNγ浓度的影响　　ELISA结果显示，与Con组比较，小鼠在应激35天后血浆中TNF-α和IFNγ炎性因子浓度升高，差异具有统计学意义;而与Stress组比较，Stress+Res组小鼠血浆中IFNγ和TNF-α炎性细胞因子浓度下降，差异有统计学意义。　　3、SIRT1通过抑制GSK3β调控小胶质细胞炎症反应　　(1) IFNγ激活BV2小胶质细胞　　用25 ng/ml IFNγ分别干预BV2细胞24h、48h和72h，Western blot结果显示，IFNγ干预24h，BV2细胞中SIRT1、AMPK蛋白表达下降，而GSK3β蛋白表达增加。　　(2) Res激活SIRT1蛋白表达　　Western blot结果显示，用20μM Res干预BV2细胞24h，可以激活SIRT1蛋白的表达，而且Res对SIRT1的激活作用是剂量依赖性的，当干预浓度超过一定范围时，Res对SIRT1的激活作用逐渐减弱。　　(3) NAM抑制SIRT1蛋白表达　　用30mM NAM干预BV2细胞24h可以抑制SIRT1蛋白的表达，用IFNγ、 Res、NAM同时干预细胞发现，NAM会抑制Res对SIRT1的激活作用。　　(4) SIRT1对细胞培养基中TNF-α、IFNγ浓度的影响　　ELISA结果显示，与Con组比较，25 ng/ml IFNγ干预BV2细胞会增加TNF-α和IFNγ的释放，使其浓度升高，且差异有统计学意义（P＜0.05）;与IFNγ组比较，IFNγ+Res组TNF-α和IFNγ浓度显著下降，且差异有统计学意义（P＜0.05），提示用Res干预BV2小胶质细胞可以抑制TNF-α和IFNγ的释放。　　实验结论：　　本实验通过慢性不可预知应激建立BABL/c小鼠抑郁模型，并通过激活SIRT1改善小鼠的抑郁样行为和炎症水平，初步验证了SIRT1在抑郁症的作用机制，得出如下结论:　　1、慢性不可预知应激5周后，小鼠表现出典型的抑郁样行为，模型建立成功。　　2、SIRT1表达下降可能是应激组小鼠表现出抑郁样行为的原因之一。　　3、激活SIRT1的表达会抑制GSK3β的表达，提示SIRT1可能通过抑制GSK3β发挥抑炎作用。　　4、慢性应激会引起神经元损伤，而激活SIRT1的表达可以改善小鼠的神经元形态，表明SIRT1有保护神经元的作用。　　5、SIRT1可通过抑制小胶质细胞GSK3β发挥抑炎作用。　　综上说明，SIRT1是机体代谢性炎症反应的重要调节因子，应激时SIRT1表达下降，激活SIRT1的表达会抑制GSK3β而起到抑制炎症反应的作用，并改善小鼠抑郁样行为。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

前言

参考文献

第一部分 小鼠抑郁模型的建立及脑组织SIRT1蛋白表达的变化

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

参考文献

第二部分 激活SIRT1对应激小鼠抑郁样行为和炎症水平的影响

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

参考文献

第三部分 SIRT1通过抑制GSK3β调控小胶质细胞炎症反应

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

参考文献

全文总结

综述 炎症反应与抑郁症关系的研究进展

在读期间发表论文和参加科研工作情况说明

致谢