激活胆碱能抗炎通路对大鼠肝缺血再灌注损伤保护作用

摘要

一、研究背景及目的　　 失血性休克、肝外伤和需在肝门阻断下完成的肝切除、移植等外科手术治疗均会对肝组织造成严重的缺血再灌注损伤。发生的病理生理机制十分复杂，有诸多因素参与，而且相互间形成制约和促进的关系。早期肝缺血再灌注损伤通常分为急性期和亚急性期，主要以急性期细胞炎症因子的释放和亚急性期的肝细胞破坏为病理生理特征。研究表明，过度炎症反应是促进及加重肝缺血再灌注损伤的主要因素之一，因此如何减轻或控制过度炎症反应成为减轻肝缺血再灌注损伤和保护肝组织的关键。尽管关于抑制过度炎症反应的研究越来越深入，但如何安全有效并且快速的抑制并改善脏器功能损害，尤其是肝缺血再灌注损伤，仍没有良好的办法。以往相关的研究主要关注体液因素和细胞因子的自分泌及旁分泌对抗炎或促炎介质释放的影响，而近年来神经及其递质的直接调节作用则越来越受到青睐。2000年由美国科学家Tracey KJ等研究发现通过直接电刺激大鼠颈迷走神经可释放乙酰胆碱并对由内毒素引起的全身炎症反应产生较好抑制的效果，因此命名为“胆碱能抗炎通路”。其后有研究发现经皮电刺激中医穴位(如足三里穴)也对由内毒素引起的全身炎症反应有类似于直接刺激迷走神经的作用，并且该作用机制可能为“胆碱能抗炎通路”。中医针灸治疗已有数千年历史，对很多疾病有着很好的疗效，某些穴位(如合谷穴、足三里穴)的抗炎作用也十分显著，但以往以现代生物学理论很难解释其作用机制。胆碱能抗炎通路的发现打破了这一僵局。可是当前的研究局限于讨论对炎症的抑制作用，对脏器尤其肝组织的保护作用研究甚少。因此本课题以大鼠肝缺血再灌注损伤为实验模型，研究电刺激中医穴位(合谷穴)对肝缺血再灌注损伤的保护作用及其作用机制是否通过迷走神经激活胆碱能抗炎通路。　　 二、实验方法　　 1.将大鼠分为假手术组和缺血再灌注损伤模型组，两组分别进一步分为空白对照组(A组)、非经络穴位电刺激组(B组)、DMPPI组(C组)和合谷穴电刺激组(D组)；　　 2.建立大鼠肝缺血再灌注损伤模型：采用3cm动脉阻断夹阻断70％肝组织入肝血流90分钟，按组别不同给予不同时间再灌注处理；建立大鼠迷走神经阻断模型：缺血再灌注损伤行膈下迷走神经切断术或缺血术前15分钟腹腔注射尼古丁受体阻断剂；　　 3.处死大鼠由下腔静脉取血5ml静置析取血清和液氮冰冻肝组织留待检测；全自动生化分析仪测定大鼠血清ALT含量；大鼠肝组织病理切片H&E染色观察肝细胞损伤；ELISA法测定大鼠肝组织中MPO水平；ELISA法测定大鼠血清中促炎因子TNF-α、IL1b、IL-6和抗炎因子IL-10的浓度；实时定量PCR测定大鼠肝组织促炎因子TNF-a、IL-6和抗炎因子IL-10的mRNA表达水平。　　 三、研究结果　　 1.假手术组ALT升高无明显差异，表明各处理因素本身均不会造成肝组织损伤；　　 2.D组血清ALT和肝组织MPO显著低于A、B组，H&E染色示肝组织损伤较A、B组轻，表明电针刺激大鼠合谷穴可有效减轻肝细胞破坏、肝组织损伤，抑制中性粒细胞的聚集和酶的释放；　　 3.D组血清促炎因子TNF-a、IL-1b和IL-6显著低于A、B组，而肝组织中促炎因子TNF-α、IL1b和IL-6的mRNA在A、B、D组中无明显差异，表明合谷穴电刺激对炎症介质的影响在蛋白水平而非分子水平；　　 4.D组抗炎因子IL-10在血清蛋白水平和肝组织mRNA水平与A、B组均无明显差异，表明合谷穴电刺激对抗炎介质无特殊影响；　　 5.D组各检测指标均与C组无明显差异，表明合谷穴电刺激与尼古丁受体激动剂DMPPI效果相似；而大鼠迷走神经阻断模型中，合谷穴电刺激这种保护肝细胞损伤和抗炎作用减弱或消失；表明胆碱能抗炎通路可能为电刺激合谷穴保护肝缺血再灌注损伤的主要机制之一。　　 四、结论　　 综上所述，本研究发现通过电刺激中医穴位预处理后的肝缺血再灌注损伤较未予电刺激或非经络穴位电刺激的肝缺血再灌注损伤显著减轻，与腹腔注射尼古丁受体激动剂激活胆碱能抗炎通路的作用一致，并且这种作用可以在各种手段阻断迷走神经传出纤维后减弱和消失，因此，我们认为电刺激中医穴位可有效保护肝缺血再灌注损伤，其主要作用机理之一为通过迷走神经来激活胆碱能抗炎通路。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

前言

第一部分 电针刺激合谷穴对缺血再灌注损伤肝组织的保护作用

一、材料和方法

二、结果

三、讨论

四、参考文献

第二部分 电针刺激合谷穴对炎症因子的抑制作用

一、材料和方法

二、结果

三、讨论

四、参考文献

第三部分 迷走神经阻断对电针刺激合谷穴后肝缺血再灌注损伤的影响

一、材料和方法

二、结果

三、讨论

四、参考文献

总结

综述 胆碱能抗炎通路的相关研究进展

在读期间论文撰写及参加科研工作情况说明

致谢