激活突变SHP-2酪氨酸磷酸酶对肝癌细胞恶性生物学行为的影响及其分子机制的探讨

摘要

背景
　　肝癌是世界上三大引起死亡的癌症之一,大约80％的肝癌患者是由肝炎病毒感染引起的,其中乙肝病毒携带者患肝癌的风险比正常人高5~15倍,大约有四分之一的乙肝病毒慢性感染者会发生肝硬化,每年有3%～8%乙肝病毒导致的肝硬化患者会恶化成肝癌。近年来越来越多的研究表明,SHP-2的激活突变及过度表达可能与实体瘤的发生和转移密切相关,但其在肝癌的发生、发展演化和转移中的作用机制尚未明确。
　　SHP-2是一种蛋白酪氨酸磷酸酶(ProteinTyrosinePhosphatase,PTP),广泛表达于各种组织和细胞中,主要在各种造血细胞中高表达。SHP-2在N末端含有2个SH2(即Src同源体2)结构域,C末端含有1个PTP催化结构域及2个酪氨酸残基(Tyr542和Tyr580)以及一个富含脯氨酸(Pro)的模体。每个SH2区都具有独立的磷酸酪氨酸结合位点。生理状态下N末端的SH2结构域与PTP结构域特异性结合抑制了SHP-2的催化活性,但在各种生长因子、干扰素以及胰岛素等刺激后,酪氨酸磷酸化的蛋白底物与SHP-2的两个SH2结构域结合,或SHP-2C端两个酪氨酸位点磷酸化结合自身的SH2结构域,暴露出PTP催化结构域,从而使SHP-2蛋白去磷酸化活性得以恢复,发挥酪氨酸磷酸酶活性和接头蛋白的功能。近年来,SHP-2激活突变在血液病方面研究已经取得许多可喜的成绩,另外SHP-2基因在实体瘤发生、发展中的作用越来越引起人们的关注。研究表明在部分肝癌细胞株中也能检测到SHP-2是呈高水平表达的;因此推测SHP-2可能在肝癌的发生发展过程中起到了至关重要的作用。然而目前有关SHP-2与肝癌相关性研究很少有报道,本课题我们将对其进行研究。
　　方法
　　(1)本研究用成功构建的SHP-2真核表达载体,转染肝癌细胞HepG2,筛选并鉴定了稳定表达SHP-2的HepG2细胞株;
　　(2)检测SHP-2激活突变及过表达对HepG2细胞增殖、克隆形成能力、凋亡和迁移侵袭的影响;
　　(3)分析SHP-2对肝癌细胞恶性生物学行为影响的可能作用机制。
　　结果：
　　(1)成功的将SHP-2野生型及突变型真核表达载体转染进HepG2细胞,挑取的单克隆细胞,经Westernblot的筛选和鉴定,最终筛选出稳定表达SHP-2的HepG2单克隆细胞株。
　　(2)SHP-2激活突变及过表达对肝癌细胞增殖和周期的影响:MTT结果显示,未转染的HepG2组和空载组细胞增殖速度接近,而突变组和过表达组增殖率明显增加;平板克隆和软琼脂克隆形成实验结果表明突变组及过表达组单克隆细胞不仅数目多于对照组和空载体组,而且体积比对照组和空载体组大;细胞周期检测显示突变组和过表达组S期细胞增殖明显快于对照组和空载组细胞。说明转染SHP-2后增加了细胞的生长能力。
　　(3)SHP-2激活突变及过表达对肝癌细胞粘附能力和凋亡的影响:粘附实验检测结果显示,突变及过表达组细胞粘附率高于对照组和空载体组;凯基Annexin-V/EGFP试剂盒检测细胞凋亡结果发现,突变组及过表达组凋亡细胞均明显低于对照组和空载体组。说明转染SHP-2增加了细胞的粘附和抗凋亡能力。
　　(4)SHP-2激活突变及过表达对肝癌细胞迁移和体外侵袭能力的影响:细胞划痕和Transwell小室检测细胞迁移法发现,激活突变及过表达组细胞迁移率明显高于空载体组和对照组;Transwell小室检测细胞体外侵袭能力发现,对照组和空载体组细胞的侵袭率明显低于激活突变及过表达组。说明SHP-2具有增强HepG2细胞体外迁移和侵袭能力的作用。
　　(5)转染SHP-2突变型及野生型真核表达载体后CD133的表达情况:流式细胞仪检测发现SHP-2激活突变及过表达细胞中CD133的表达量明显高于空载体组和对照组,说明转染SHP-2能促进肿瘤干细胞的形成。
　　(6)SHP-2激活突变及过表达影响肝癌细胞恶性生物学行为可能机制:Westernblot检测发现,SHP-2激活突变及过表达组细胞磷酸化的AKT/ERK以及p38的水平明显高于空载体组和对照组,表明转染SHP-2可促进PI3K/AKT及RAS-RAF-MAPK途径的活化。
　　结论
　　(1)成功转染了SHP-2野生型及突变型真核表达载体,鉴定并获得稳定的细胞株;
　　(2)SHP-2激活突变及过表达促进了HepG2细胞增殖、粘附、克隆形成、迁移和侵袭能力以及细胞抗凋亡能力;
　　(3)SHP-2对HepG2细胞恶性生物学的作用与RAS-RAF-MAPK/PI3K-AKT信号转导途径的激活有关。

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1前 言

2 材料与方法

2.1主要仪器设备

2.2 常用溶液的配制

2.2.1 细胞培养相关试剂

2.2.2 SDS-PAGE及免疫印迹（Western Blot）实验常用试剂

2.2.3 细菌培养基

2.2.4 琼脂糖凝胶电泳

2.2.5 细胞培养及免疫沉淀试剂

2.3主要试剂

2.4主要实验方法

2.4.1 菌株及质粒获取

2.4.2 肝癌HepG2细胞的培养及G418浓度筛选

2.4.3 HepG2细胞的转染及稳定细胞系建立

2.4.4 Western blot 法（1）细胞培养：

2.4.5 细胞划痕法检测细胞体外迁移能力

2.4.6 Transwell 小室法检测细胞体外迁移能力

2.4.7 Transwell 小室法检测细胞体外侵袭能力

2.4.8 MTT 法检测细胞增殖能力

2.4.9 细胞二维克隆形成能力的检测

2.4.10 细胞三维克隆形成能力检测

2.4.11 纤维粘连蛋白黏附实验

2.4.12 流式细胞仪技术检测CD133的表达情况。

2.4.13 凯基细胞周期试剂盒检测细胞周期

2.4.14 凯基Annexin-V/EGFP试剂盒检测细胞凋亡

2.4.15 Western blot 检测 Erk1/2、Akt 及 p38 MAPK 信号途径的活化情况

2.4.16 统计学处理

3 结果

4讨论

5结论

参考文献

个人简历

致谢

综述