转化生长因子-β1降低大鼠自发性癫痫发作并抑制胶质细胞活化

摘要

目的:转化生长因子-β1(TGF-β1)已被证实对多种脑损伤疾病所致的神经元损伤具有直接的神经保护作用,但是外源性的TGF-β1在对由匹罗卡品所致的癫痫持续状态引起的的自发性癫痫发作、胶质细胞活化增生、神经元死亡和苔藓纤维发芽的作用仍不甚明了。我们通过运用新型、无创、有效的经鼻给药途径,绕开血脑屏障直接将TGFβ1递送到大鼠中枢神经系统中,观察TGF-β1对大鼠慢性期自发性反复癫痫发作的抑制作用并探讨其可能的内在抗癫痫形成机制。
　　方法:健康雄性SD大鼠随机平均分为正常对照组(Control, n=25),匹罗卡品模型组(Pilo-group, n=25),和TGF-β1治疗组 (TGF-β1 group, n=25)。TGF-β1组大鼠经鼻腔给予重组人TGF-β1,同时Pilo-组及Control组分别经鼻给予相同容量的PBS溶液,24小时之后通过匹罗卡品腹腔注射建立癫痫持续状态(status epilepticus, SE)模型,SE 后 50min,腹腔注射 10％水合氯醛 350mg/kg 终止发作。SE 建立后7d,分别取各组大鼠5只放入特定笼子中,通过12小时动态视频观察其活动,记录其自发性癫痫发作的次数、发作等级及持续时间,3w后观察结束,后断头取脑,采用冰冻切片经Timm染色观察苔藓纤维发芽(Mossy fiber sprouting,MFS)的情况。余下老鼠分别于不同的固定时间点断头取脑,通过胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)和离子钙结合接头分子1(Ionized calcium binding adaptor molecule 1,Iba1)免疫组化观察癫痫大鼠海马组织胶质细胞的活化,采用尼氏(Nissl)染色法观察海马区存活的神经元数目。
　　结果:1.TGF-β1抑制自发性癫痫发作:Control组大鼠生长良好,未观察到任何癫痫发作;Pilo组大鼠在癫痫持续状态后第9d时首次记录到自发性癫痫发作;TGF-β1治疗组大鼠在SE后第12d首次出现自发性发作;并且TGF-β1治疗组大鼠癫痫平均每日发作次数、等级分数及持续时间均较Piol组有明显减少。
　　2.TGF-β1抑制癫痫大鼠海马区活化胶质细胞的过度激活。Control组大鼠海马胶质细胞有基础表达,数量较少,星形胶质细胞形态学表现为胞体较薄,周围突起较少;小胶质细胞数量也较少,形态学表现为胞体较薄,周围有大量树枝状突起;在匹罗卡品模型组大鼠海马区胶质细胞明显增加,激活的星形胶质细胞形态学亦发生改变表现为:胞体肥大,突起增大增粗,并可能出现极化等并伴有功能学改变;激活的小胶质细胞形态学为胞体肥大变圆,周围突起减少,变短增粗,意味着吞噬作用的激活。TGF-β1组大鼠海马区活化的胶质细胞数较Pilo-组相比见有显著降低,14d时最明显,基本降至正常水平。
　　3.TGF-β1抑制神经元死亡:为明确TGF-β1是否能有效阻止匹罗卡品所致的神经元死亡,我们利用Nissl染色方法观察海马CA3区存活神经元的数目。Control组大鼠海马区锥体细胞未见明显丢失,Pilo-组在SE后显示出有大量神经元丢失,SE后14d最明显;但TGF-β1治疗组Nissl染色存活神经元较Pilo组相比有明显增多,差异有统计学意义(p<0.05)。
　　4.TGF-β1抑制匹罗卡品所致癫痫大鼠苔藓纤维发芽。我们通过Timm染色方法观察TGF-β1是否具有抑制癫痫苔藓纤维发芽的作用。结果:Control组大鼠海马CA3区分子层未见明显的Timm染色颗粒;Pilo组大鼠在海马CA3区Timm染色颗粒呈连续密集分布,并深入锥体细胞之间;TGF-β1组大鼠海马CA3区见不连续的、散在分布的Timm染色颗粒,说明TGF-β1具有抑制异常的苔藓纤维发芽的作用。
　　结论:经鼻给予TGF-β1可以显著降低癫痫大鼠慢性期自发性重复性癫痫发作的频率、发作程度及持续时间,同时抑制了胶质细胞的过度活化,并有效阻止了癫痫所引起的神经元死亡和苔藓纤维发芽;其潜在的抗癫痫形成的内在机制可能与抑制胶质细胞过度活化有关。同时经鼻腔给药作为一种全新、简单、无创、有效的中枢给药途径,可以避开血脑屏障阻隔的,减少不必要的额外系统损伤,有希望为治疗其它中枢神经系统疾病提供有实用前景的一条新思路。

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1.引言

1.1 癫痫治疗理念的转变：从抗癫痫发作治疗到抗癫痫形成治疗

1.2 脑部炎症反应与癫痫

1.2转化生长因子-β1特性

1.3 假说提出

2.材料和方法

2.1 材料

2.2 实验方法

2.3 细胞计数：

2.4 统计学方法：

3.结果

3.1 TGF-β1具有明显的抗癫痫作用

3.2 TGF-β1抑制癫痫持续状态后星形胶质细胞的活化

3.3 TGF-β1显著抑制小胶质细胞的活化数目

3.4 TGF-β1减少神经元死亡

3.5 TGF-β1抑制MFS

4.讨论

经鼻给予TGF-β1降低大鼠自发性癫痫发作

TGF-β1抑制星形胶质细胞的活化、增生

TGF-β1抑制小胶质细胞并阻止神经元的死亡

细胞因子与癫痫：

TGF-β1显著抑制海马区苔藓纤维出芽

5.结论

参考文献

附录

致谢

综述