Survivin、Livin和NF-kB在大肠癌中的表达以及siRNA沉默Survivin基因对大肠癌细胞HT29增殖和凋亡的影响

摘要

目的：探讨大肠癌组织中凋亡抑制蛋白Survivin、Livin及核因子NF-κB表达、相互关系及临床意义;观察Survivin在人大肠癌细胞系HT29中的表达及siRNA沉默Survivin基因后对人大肠癌细胞系HT29的Survivin蛋白表达、细胞增殖及凋亡的影响。
　　方法：第一部分:采用免疫组织化学S-P法检测65例大肠癌组织和25例正常大肠粘膜组织中Survivin、Livin及NF-κB表达的状况;第二部分:以脂质体lip-2000为载体,用针对Survivin特异靶点的siRNA转染入人大肠癌细胞系HT29后,应用免疫细胞化学S-P法、WesternBlot检测Survivin蛋白表达变化;MTT法检测细胞增殖;流式细胞技术检测细胞凋亡。
　　结果：第一部分:Survivin、Livin及NF-κB蛋白在大肠癌组织中的阳性表达率分别是73.8％(48/65)、72.3%(47/65)、52.3%(34/65),均明显高于大肠正常黏膜组织12%(3/25)、24%(6/25)、20%(5/25)(P<0.05)。Survivin和Livin蛋白表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移及临床Duke’s分期有关,与患者年龄、性别及肿瘤分化程度无关。Survivin、Livin及NF-κB蛋白在大肠癌组织表达两两呈正相关。第二部分:免疫细胞化学结果显示:细胞系HT29正常对照组,脂质体对照组及阴性错配对照组细胞浆均呈强阳性表达(深棕黄色),Survivin-siRNA组细胞浆均呈弱阳性表达(浅棕黄色);Westernblot结果显示:HT29细胞系Survivin-siRNA组细胞的蛋白条带亮度明显低于正常对照组,脂质体对照组和阴性错配对照组;MTT检测结果:与阴性错配对照组相比,Survivin-siRNA组和5-Fu组细胞生长出现明显的抑制(P<0.05),不同时段(24h、48h、72h)肿瘤细胞增殖抑制率之间有显著差异(P<0.05)。流式细胞术检测结果表明:与空白对照和阴性错配对照细胞组相比,HT29细胞的Survivin-siRNA组,出现明显亚二倍体峰,细胞凋亡比例增加。
　　结论：第一部分:Survivin、Livin及NF-κB表达在大肠癌发生过程中起重要作用,检测Survivin、Livin及NF-κB表达水平有助于反映大肠癌进展和预后判断;第二部分:siRNA沉默Survivin基因可以抑制大肠癌细胞增殖,促进凋亡;应用RNA干扰技术有望成为大肠癌基因治疗的一种有效的方法。

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1 前言

2 材料与方法

2.1 标本来源

2.2 细胞来源

2.3 仪器设备

2.4 主要试剂、溶液及配制

2.5 实验方法

2.6 结果判断

2.7 统计方法

3 结果

3.1免疫组化结果

3.2 免疫细胞化学结果

3.3 蛋白免疫印迹法（ Western blot）结果

3.4 MTT 结果

3.5 流式细胞术结果

4 讨论

4.1 Survivin 在大肠癌组织中的表达

4.2 Livin 在大肠癌组织中的表达

4.3 NF-κB 在大肠癌组织中的表达

4.4 Survivin、Livin 与 NF-κB三者在大肠癌组织中的关系

4.5 靶向siRNA转染后Survivin蛋白在HT-29大肠癌细胞中的表达情况及意义

4.6 siRNA 沉默 Survivin 基因后对大肠癌细胞系增殖的影响

4.7 siRNA 沉默 Survivin 基因后对大肠癌细胞系凋亡的影响

5 结论

参考文献

附录

致谢

综述