类人胶原蛋白分离纯化和肝再生磷酸酶-3功能特性的研究

摘要

胶原蛋白是人体最丰富的蛋白质，对生命的生理功能起着多重作用。近年来研究主要突出了胶原蛋白在多种癌症中的重要性，其主要应用于癌症转移、血管生成、促细胞生长和癌症检测靶向与治疗等。虽然胶原蛋白对生命有着若干的优点，但是在现代生活中，机体各种各样的癌症如结肠癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、宫颈癌等发病的种类却在逐年增加。经研究，这些癌症有着一个共同的酶(肝再生磷酸酶-3，PRL-3)出现了过表达，促进了癌症转移和恶化，也导致了体内组织胶原蛋白出现迅速的减少和降解，从而加重了病人的病情，增加了治疗过程的难度。　　由于胶原蛋白和PRL-3都对人体很重要，若能对重组胶原蛋白和PRL-3基本性质存在的问题进行进一步研究，就可以为癌症治疗和药物研发提供依据，并为了解二者在癌症病发过程中的变化提供参考，从而达到为癌症病患量体裁衣的治疗目的。因此，进一步研究重组类人胶原蛋白在分离纯化过程中遇到的问题，可以使其能更好的应用于临床癌症的研究，同时研究因PRL-3异常磷酸化而导致癌症和免疫缺陷的功能性特征不清楚这一关键问题就显得尤为重要。本论文的主要内容包括以下几个方面：　　1)本文提出用温和的多元醇添加剂修饰类人胶原蛋白（Human-like Collagen,HLC），然后再用阳离子交换色谱进行分离纯化。通过选择不同多元醇修饰HLC，找到最佳修饰HLC的多元醇添加剂，之后对离子色谱条件进行优化。多元醇修饰HLC不仅能减少三螺旋胶原蛋白因分子间作用力的疏水键而形成的多聚物，也能阻止HLC在纯化过程中形成多聚物，打破了胶原蛋白在分离纯化过程中因分子间作用力形成多聚物而移除杂质困难的僵局。将获得的最佳多元醇1,2-丙二醇作为HLC的修饰剂，不仅能获得最佳的分离效果，还可通过多次进样实现色谱柱的高效利用。最后，用圆二色谱、分析型凝胶过滤色谱和透射电镜等分析了多元醇修饰HLC三螺旋结构的性质和蛋白形态等。　　2)通过Pierce High-Capacity Endotoxin Removal Resin对重组HLC进行内毒素的移除。基因工程下重组蛋白也有一个棘手的问题就是内毒素的污染。这也是目前重组蛋白难以攻克的难题之一。因此，在对HLC内毒素移除中，选用吸附内毒素多且成本不高的High-Capactiy Endotoxin Removal Resin树脂。尽管此树脂提供了参考说明，但是对HLC中内毒素的移除效果不佳。为了更好的移除HLC的内毒素，本论文中选用了温和的Tris-醋酸缓冲液(TA)，用该树脂对HLC进行内毒素的移除，并对Tris-醋酸缓冲液条件和可能影响内毒素移除的条件做了优化。以最大程度移除内毒素且保证HLC不变性聚集为必须条件，同时以不引进难以移除或者有毒的物质如Triton、Tween等为基本条件移除内毒素，实现了高效率移除内毒素及高回收率的蛋白，并为后续的生物产品的制备和研发提供原材料。　　3)对体外调控PRL-3磷酸酶磷酸化的活性进行研究。已经证实在多种肿瘤发生和转移癌症中涉及到PRLs的酶活性，其多种癌症与PRL-3过表达相关，但是在多种转移癌中PRL-3磷酸酶磷酸化的活性调控还不清楚。因此，在本论文中，主要研究了体外PRL-3磷酸酶磷酸化活性的调控，通过不同条件下的荧光偏振、核苷酸及核苷酸类似物的筛选及其质谱分析磷酸化肽段等手段研究了如何调控PRL-3磷酸酶的磷酸化活性。这一研究不仅能为癌症药物抑制剂提供一个目标，也能为进一步研究其他的蛋白质酪氨酸磷酸酶(Protein Tyrosine Phosphatase，PTP)的磷酸化机理提供有利的证据。　　4)通过对半胱氨酸磷酸化调控研究了PRL-3与周期素M3（CNNM3）胱硫醚β合成酶(CBS)对域(pair domains)复合物之间的相互作用。尽管PRLs的磷酸酶活性机理可以为治疗提供潜在的依据，但是在能量代谢和肿瘤发展中，PRL和CNNM的离子转运体可以相互作用，并通过Mg2+转运体抑制CNNM。本文通过半胱氨酸的磷酸化来研究PRL-3与CNNM3 CBS对域的复合物形成，并通过二者复合物晶体结构的研究，探寻二者相互作用下的结合位点和结合关系，再通过对二者晶体结构的分析，得到有力的结合位点。利用二者结构中的磷酸化位点和结合位点为下一步药物的研发和对癌症的治疗检测提供有利的依据。　　5)研究纯化后HLC与PRL-3在癌症细胞实验中的相互关系。通过划痕实验和细胞裂解后进行Westem Blotting实验来研究重组的HLC是否会抑制PRL-3的过表达，从而为HLC应用于因PRL-3过表达导致的癌症提供药物研发和治疗，并通过HLC对机体胶原蛋白的外源补充来减轻或者抑制因PRL-3过表达引起癌症的迅速转移。

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