紫杉醇诱导人肝癌细胞和正常肝细胞凋亡的microRNA表达谱分祈及其分子机制研究

摘要

肝细胞癌是世界上常见的癌症之一，死亡率排第三位。到目前为止，人们已经在预测肝癌的生物学预后和新治疗策略开发上进行了很多尝试。近年来随着microRNA技术的发展，我们对生物分子调控机制的理解得以扩大，使得我们能更深入地了解肝癌的microRNA介导途径。紫杉醇，作为一种常用的抗肿瘤药物，己被广泛用于临床治疗包括乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部癌等在内的人类肿瘤。由此推测，microRNA可能参与紫杉醇化疗肝癌的调控过程。对紫杉醇药物作用前后的细胞microRNA进行相关分析，能更好阐释该类药物对肿瘤作用和耐药性的分子机制，并可为寻找新的细胞周期调控靶向因子和耐药逆转策略提供理论依据。　　我们通过MTT实验确定合适的药物处理浓度，通过细胞形态学观测、FDA/PI细胞活性检测和DAPI细胞凋亡检测等多种形态观测手段来比较分析紫杉醇凋亡HepG2肝癌细胞和L02人胚肝细胞的差异。我们利用高通量芯片技术对紫杉醇作用前后的正常细胞和肿瘤细胞中的miRNA表达谱的变化进行研究，结合生物信息学的方法筛选差异表达的miRNAs分子，并对其表达模式进行归类。利用靶基因预测软件对发生显著差异变化的miRNAs所调控的mRNA基因进行预测分析，利用RT-PCR技术对相关miRNA及其靶控mRNA进行验证。再进一步结合GO分析和Pathway分析，对分子机制进行分析。　　通过分析得到以下结论：　　(1)紫杉醇对HepG2和L02细胞均有明显抑制作用：药物作用24h的IC50为93.02 nM/L，同等药物浓度下，HepG2和L02受到的影响不同，细胞死亡率差异较大，HepG2细胞在药物作用24h后出现明显的凋亡特征，核固缩破裂。　　(2)用差异表达的miRNAs表达谱可将肝癌细胞和正常肝细胞正确区分：本论文发现相对于L02细胞，HepG2细胞共有34个miRNAs发生了显著的表达变化，其中13个上调，21个下调，预测靶基因较多集中于肿瘤通路和PI3K/Akt信号通路。　　(3)紫杉醇药物处理的确影响了肝癌细胞的miRNA表达：本论文共发现了54个差异表达基因，其中41个上调，13个下调，紫杉醇化疗对HepG2细胞影响最大的是TGF-b信号通路，涉及靶基因最多的是PI3K/Akt通路。　　(4)紫杉醇药物处理也影响了正常肝细胞的miRNA表达，且变化的基因与肝癌细胞不完全一致：本论文共发现了1 16个差异表达基因，其中49个上调，67个下调，紫杉醇化疗对L02细胞影响最大的是P53信号通路。　　(5)本论文发现紫杉醇化疗后，miR-1290、miR-508-5p、miR-509-5p这3个miRNA在HepG2细胞和L02细胞中发生同样变化，提示可能是紫杉醇的作用基因。　　本论文分析了microRNA在HepG2和L02细胞接受紫杉醇处理前后的显著表达差异，相关靶基因涉及许多重要的生物途径包括P13K/Akt信号通路、MAPK信号通路、TGF-β信号通路、P53信号通路、ErbB信号通路、细胞周期、mTOR信号、Jak-STAT信号耐受、凋亡等。本论文提出紫杉醇化疗肝癌过程中，作为PI3K/Akt通路下游重要分子的CCND1和PDCD4可被miR-21、miR-183*、miR-101、miR-19b、miR-27b，miR-451、miR-107、miR-1290、miR-1246、miR-1260协同调控，CCND1表达下调，PDCD4表达上调，促进细胞凋亡，发挥抗肿瘤作用。紫杉醇化疗对正常肝细胞也造成影响，其小表达下调的miRNAs基因功能富集于细胞形态和发育等，其毒性功能与消化道反应、血液病变、肾毒性有关，可从中筛选监测临床不良反应的预测标志物。进一步调查明确这些受变化microRNA调控的通路是我们的下一步工作。详细了解其特点将有助于紫杉醇治疗肝癌的microRNA异常早期诊断新方法的开发和更好的个体化用药管理。

目录

第一个书签之前