海带提取物对百草枯诱导秀丽线虫氧化应激损伤的保护作用研究

摘要

活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)是机体正常代谢的中间产物,有氧生物会不可避免地暴露在ROS环境中。正常生命体能够依靠机体内的抗氧化系统来维持活性氧的动态平衡。当机体受到各种刺激时,如饥饿、电磁辐射、高原低氧等,机体内的氧化和还原失去平衡而产生大量活性氧,一旦超出了机体能承受的抗氧化能力,活性氧就直接攻击生物大分子如蛋白质、脂肪及核酸等,导致机体组织的氧化应激(oxidativestress)损伤,诱发神经退行性疾病、肿瘤、炎症等多种疾病。因此,清除机体中多余活性氧是防治此类疾病的重要策略。研究发现,一些天然植物提取物具有潜在的抗氧化活性,可成为治疗此类疾病的候选药物。本文选择海带提取物等几种天然植物提取物进行体外抗氧化活性评价,并且选择海带提取物在秀丽线虫中进行抗氧化活性评价,旨在为活性氧损伤相关疾病提供新的干预策略。主要研究结果如下:
　　一、海带提取物等四种天然提取物的抗氧化/还原能力和清除自由基活性比较
　　目的:体外实验比较海带提取物(LaminariajaponicaExtract,ELJ)、猴头菇多糖(HericiumerinaceusPolysaccharides,HEP)、马尾藻多糖(SargassumpallidumPolysaccharides,SPP)、牛膝糖肽(AchyranthesbidentataGlycopeptide,ABG)四种天然植物提取物的总抗氧化能力、还原能力、清除超氧阴离子能力的差异,寻找体外抗氧化活性较强的植物提取物。
　　方法:总抗氧化能力测定采用FRAP法,其原理是酸性条件下抗氧化物可以还原Ferric-tripyridyltriazine(Fe3+-TPTZ)产生蓝色的Fe2+-TPTZ,随后在最高吸收峰593nm处测定蓝色的Fe2+-TPTZ即可获得样品中的总抗氧化能力。还原能力测定采用铁氰化钾还原法,其原理是通过测定待测抗氧化剂转化Fe3+为Fe2+的能力得到待测抗氧化剂的还原能力。清除超氧阴离子采用的检测方法是NBT-光还原法进行,该反应中VB2和EDTA在光照下发生反应,产生超氧阴离子,超氧阴离子与NBT发生反应,在560nm处有最大吸收峰。在反应体系中加入植物提取物,若植物提取物与超氧阴离子反应,则会阻止超氧阴离子与NBT反应,在560nm处吸收峰会发生变化,根据植物提取物与超氧阴离子反应的程度即可计算植物提取物清除超氧阴离子活性能力。
　　结果:海带提取物(ELJ)、猴头菇多糖(HEP)、马尾藻多糖(SPP)、牛膝糖肽(ABG)四种天然植物提取物的总抗氧化能力由强到弱依次为ELJ、HEP、SPP、ABG。还原能力由强到弱依次为HEP、ELJ、ABG、SPP。清除超氧阴离子活性由强到弱依次为ELJ、HEP、ABG、SPP。综合比较,可见ELJ具有较强的体外抗氧化活性,后续针对该种提取物进行深入研究。
　　二、海带提取物对百草枯诱导秀丽线虫氧化应激损伤的保护作用研究
　　目的:建立秀丽线虫百草枯(PQ)氧化应激损伤模型,选择体外抗氧化活性较强的海带提取物(ELJ)进行秀丽线虫体内抗氧化活性评价实验。
　　方法:利用秀丽线虫制备PQ氧化应激损伤模型。利用海带提取物干预该模型秀丽线虫,通过体长(bodysize)、成虫率、产卵等指标进行抗氧化效果评价;通过检测ROS水平、凋亡及氧化应激相关差异基因的表达来研究海带提取物保护机制。结果:海带提取物能恢复线虫PQ损伤后的体长变短,提高线虫成虫率、产卵率,降低线虫体内的ROS水平,减少线虫生殖腺细胞的凋亡数目,并且能通过影响体内抗氧化基因daf/sod发挥抗氧化作用。
　　三、不同状态大肠杆菌OP50对秀丽线虫生长发育的影响
　　目的:比较不同方式灭活处理的食物菌——大肠杆菌OP50对线虫生长发育的差异,寻找合适的线虫食物菌的灭活方法,避免活体OP50菌对实验的干扰。
　　方法:根据实验室现有条件,选择65℃热灭活和钴60γ射线照射两种灭活的线虫食物菌的方式分别和正常活菌作对照,比较各组线虫生长发育情况,体长差异,产卵数量变化,以及不同处理的食物菌的琥珀酸脱氢酶的活性变化。
　　结果:用两种方式灭活的OP50菌饲喂线虫后,线虫的生长发育出现显著差异,热灭活的菌导致线虫生长速度降低,而钴60γ射线照射的菌对线虫生长发育没有影响;噻唑蓝(3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,MTT)结果提示这种差异可能是由于钴60γ射线照射OP50后,蛋白以及其一些酶的活性出现变化的缘故。同时,我们还发现对OP50使用紫外线照射和超声处理后饲喂线虫,其生长发育出现的变化和热灭活OP50饲喂的结果类似。综上所述,钴60γ射线照射是一种较合适的灭活线虫食物菌的方法,为排除药物和毒物可能会间接通过影响OP50从而影响秀丽线虫的发育过程的干扰因素、提高基于秀丽线虫研究数据的可靠性提供了重要参考。

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引言

第一章 海带提取物等四种天然植物提取物抗氧化/还原能力和清除自由基活性比较

1.1材料

1.2方法

1.3结果

1.4讨论

第二章 海带提取物对百草枯诱导秀丽线虫氧化应激损伤的保护作用

第一节 海带提取物对线虫氧化应激损伤的保护作用

第二节 海带提取物的保护作用的机制初步研究

第三章 不同状态大肠杆菌OP50对线虫生长发育的影响

3.1材料和方法

3.2结果

3.3讨论

全文结论

参考文献

附录一 英文缩略词表

附录二 主要溶液的配制

附录三 主要仪器设备

文献综述

在学期间发表的论著发表论著（附一篇）

在学期间发表的论著发表共同作者SCI论文（附一篇）

个人简历

攻读学位期间发表或投稿的文章

攻读学位期间申请的专利

致谢