弓形虫排泄分泌抗原(ESA)通过内质网应激信号通路诱导神经干细胞凋亡

摘要

目的：探讨刚地弓形虫对体外培养的神经干细胞(NSCs)凋亡水平的影响及其分子机制。
　　方法：(1)NSCs的分离、传代及鉴定。将6-8周龄的ICR小鼠按照雌:雄=2:1的比例合笼,在孕13-15d,剖宫取小鼠胎盘,分离两侧大脑半球,制备单细胞悬液,传代培养,传代过程中使用Nestin抗体对其进行免疫荧光染色鉴定。(2)小鼠全基因组表达谱芯片筛查弓形虫感染组NSCs差异表达基因。建立弓形虫与NSCstranswell共培养体系,上室加入1×106个RH速殖子,下室为NSCs,感染48h后,收集感染组和对照组的下室NSCs,分别提取细胞的总RNA,进行全基因组表达谱分析,筛查差异表达基因并进行GO分析。(3)NSCs凋亡的检测。采用transwell共培养体系,上室中加入2×105、1×106、5×106个速殖子,与下室中NSCs共培养12h、24h和48h后,收集下室NSCs细胞,运用AnnexinV-FITC/PI双染法和DNALadder法检测NSCs的凋亡情况。(4)内质网应激信号通路抑制剂预处理后NSCs的凋亡情况及相关蛋白分子的表达水平。分别用0.5mmol/LTUDCA和4μmol/LZ-ATAD-FMK预处理NSCs6h,然后建立共培养体系,感染48h后收集细胞,AnnexinV-FITC/PI法检测细胞凋亡,免疫印迹检测CHOP、caspase12、JNK、p-JNK的蛋白表达水平。
　　结果：(1)成功制备小鼠胚胎NSCs并在体外传代培养,NSCs特异性标记蛋白nestin表达阳性。(2)基因表达谱芯片筛查结果发现,与正常对照组相比,弓形虫共培养48h的NSCs有973个基因表达上调(≥2倍)、871个基因表达下调(≤2倍)。GO分析显示细胞凋亡生物学过程受到显著影响,有15个参与此过程的基因表达明显升高(≥2倍)。(3)NSCs与弓形虫共培养12h、24h、48h后,其凋亡率分别为26.21±0.78％、37.01±1.23%和45.70±0.56%,而对照组的凋亡率分别为21.12±1.34%、25.13±2.07%和25.31±1.03%,弓形虫与NSCs共培养24h和48h后,感染组的凋亡率与对照组相比存在显著性差异(P<0.01),同时发现随着时间的延长,感染组的凋亡率有逐渐增加的趋势。2×105、1×106、5×106个RH速殖子共培养组的NSCs在48h的凋亡率为分别为36.72±4.52%、45.73±2.42%和56.94±1.35%,明显高于对照组的27.52±1.80%。(4)TUDCA和Z-ATAD-FMK预处理组,NSCs的凋亡率分别为28.41±0.60%和27.63±0.82%与单纯弓形虫共培养组的凋亡率(52.92±0.95%和49.81±0.91%)相比,抑制剂明显降低了NSCs的凋亡水平(P<0.01)。(5)免疫印迹显示,共培养组NSCs的CHOP、caspase12和p-JNK表达上调或激活;TUDCA预处理可抑制上述基因的表达或信号通路的激活,而Z-ATAD-FMK预处理仅抑制caspase12的表达水平。然而,与对照组相比,感染组和抑制剂预处理组的JNK表达水平未出现显著性变化。
　　结论：(1)弓形虫ESA诱导NSCs的凋亡,并呈现出时间和剂量依赖性。(2)弓形虫ESA可通过内质网应激信号通路来诱导NSCs的凋亡。

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1 前言

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

3 结果

3.1 神经干细胞培养形态和免疫荧光法鉴定结果

3.2 基因表达谱芯片筛查结果

3.3 弓形虫共培养对NSCs凋亡水平的影响

3.4 抑制剂预处理对NSCs凋亡水平及ERS凋亡通路活化的影响

4 讨论

5 结论

参考文献

附一

附二

附三（综述）