人中脑星型胶质来源的神经营养因子MANF基因启动子区域的克隆及功能研究

摘要

MANF(Mesenceph alicastrocyte-derived neurotrophie factor)基因又名ARP(arginine rich protein)或Aremt(Arginine-Rich,Mutatedin Earlystageof Tumors)。最初被鉴定是一个在不同的肿瘤组织中高度突变的基因,其编码的蛋白定位于内质网(endoplasmicreticulum,ER)、高尔基体(Golgiapparatus)。2003年有学者在大鼠星形胶质细胞株培养上清液中分离纯化得到MANF蛋白,并且发现该蛋白具有促神经细胞生长作用,因此又被命名为中脑星形胶质来源的促神经生成因子。该蛋白的分子量是20kD,并且是一种分泌性蛋白质。后来证明,MANF基因在ER应激反应时特异性高表达,在脑缺血、帕金森氏病等多种神经系统疾病中对神经元发挥较好的保护作用。MANF蛋白可以保护细胞避免ER应激诱导的细胞凋亡。在最近的研究中,我们发现MANF基因在类风湿性关节炎,SLE等自身免疫系统疾病的炎症病灶和炎症细胞中有特异性的高表达。然而,MANF基因的转录调控机制及蛋白质功能目前尚未深入研究。
　　本研究的目的主要集中对人MANF基因启动子的结构和功能进行分析,在转录水平上,研究人MANF基因上游启动子区域的转录调控机制,分析MANF基因在ER应激和炎症通路中表达上调的机制。结果发现,MANF启动子受多个转录因子调控,其中最主要的转录因子XBP1、SP1和AP1有正向调控作用。本论文主要研究内容及结果如下:
　　(1)通过对人MANF基因的5’端非翻译区pEGFP-1-MANF-5F和pGL3-MANF-5F质粒的构建,利用倒置显微镜下观察绿色荧光以及体外双荧光素酶报告基因实验的结果分析,我们确定了克隆人MANF基因5’端序列具有启动子活性;
　　(2)ER应激诱导剂tunicamycin(TM)刺激细胞,体外双荧光素酶报告基因结果分析,我们观察到ER应激可以明显上调人MANF基因启动子活性;
　　(3)运用TESS在线生物学软件对人MANF基因的序列进行分析,结果显示此启动子区域主要存在转录因子XBP1、SP1和AP1的结合位点;
　　(4)在N2A细胞中过表达XBP1、SP1和AP1,体外双荧光素酶报告基因实验初步证实各转录因子XBP1、SP1和AP1对人MANF基因启动子区的调节作用;
　　(5)通过进行截短质粒和转录因子结合位点定点突变实验,进一步发现转录因子XBP1、SP1和AP1正向调节MANF基因启动子活性;
　　(6)染色质免疫沉降实验(ChIP)证明在活体细胞中转录因子XBP1能够结合到人MANF基因的启动子上。
　　因此,我们的实验结果表明ER应激可通过转录因子XBP1促进人MANF基因上游启动子区域的转录活性,并且SP1和AP1也同时可以促进MANF基因的表达,这些结果为理解MANF基因在ER应激和炎症中发挥重要功能提供了实验依据。

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1. 前言

2.实验材料

2.1 细胞株、菌株

2.2 实验仪器与设备

2.3 化学试剂

3. 实验方法

3.1 主要试剂溶液的配方

3.2 人基因组DNA提取

3.3．MANF启动子区域的扩增

3.4 质粒的构建

3.5 细胞转染用的去内毒素高纯质粒的制备

3.6 脂质体Lipofectamin 2000介导哺乳动物细胞瞬时转染

3.7 双荧光素酶的活性检测

3.8 TESS生物软件分析启动子上游顺式作用元件

3.9 免疫印迹(Western Blot)

3.10 定点突变质粒的构建

3.11 染色质免疫沉淀实验

3.12 数据统计学分析

4．实验结果

4.1生物信息学预测

4.2 人MANF基因潜在启动子区域的相关质粒的构建

4.3 MANF基因启动子EGFP报告基因的活性分析

4.4 MANF基因启动子的双荧光素酶活性分析

4.5过表达XBP1、AP1和SP1增强MANF基因启动子活性

4.6 MANF蛋白自身转录激活检测

4.7 MANF基因启动子5’端截短质粒的构建

4.8 MANF启动子截短体启动子活性的测定

4.9 MANF启动子区域中的ERSE顺式作用元件是一个正性激活元件

4.10 各转录因子结合位点定点突变后的MANF基因启动子区荧光素酶活性分析

4.11 染色质免疫沉淀分析XBP1在体内与人MANF基因启动子序列相互结合

5. 讨论

6. 结论

7.创性新

参考文献

附录

致谢

综述