维生素D类似物EB1089对肝癌细胞SMMC-7721生长抑制作用的研究

摘要

研究背景：
　　原发性肝癌(primary hepatic carcinoma,PHC)在全球范围内恶性肿瘤的发病率位于第五位,位于全球恶性肿瘤致死率第二位。目前肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC,简称肝癌)是全球原发性肝癌病人中最为常见的病理类型,所占比例大约为70％到85%。尽管肝癌的研究已经进行多年,但目前仍未完全阐明其病因和分子生物学机制。时至今日,仍然没有特别有效的治疗肝癌的方法,肝癌患者的整体预后情况不容乐观。因此,对导致HCC发生发展的的分子生物学机制进行深入研究,对于提高HCC诊断及治疗水平具有十分重大的意义。
　　大量研究结果表明,维生素D可能对肝癌有抑制作用,但研究结果并不完全一致。目前主要认为维生素D可能通过抑制细胞增殖、促进细胞分化、诱导细胞凋亡等方式发挥其保护作用,但确切机制仍然不明。探讨维生素D保护机制并进一步阐明其与肝癌发病关系,对于对改善肝癌患者的长期生存率有着非常积极的意义制定肝癌相关预防策略和措施具有重要意义。
　　脂肪酸辅酶A连接酶(fatty-acid-CoA ligase,FACL)属于酰基辅酶A连接酶家族,是控制游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)的关键酶,它可以通过催化细胞内游离脂肪酸细胞转化为脂肪酸酰基辅酶A(acyl-CoAs)这一方式影响脂肪酸的代谢。根据它的基质特异性和在不同组织的分布,在人体中含有5种亚型:FACL1,3,4,5和6。近年来越来越多的研究表明FACL在多种恶性肿瘤中呈现高表达。最近研究发现维生素D及其类似物可以通过影响前列腺癌内FACL的表达来抑制肿瘤的生长增殖。
　　然而,维生素D会引起人体血钙浓度上升这一副作用限制了其在临床上用于抗肿瘤的治疗。EB1089是一种维生素D类似物,在促进肿瘤细胞生长、分化反面有着更好的效果,而不会引起明显的血钙上升。本研究旨在通过研究维生素D类似物EB1089对肝癌细胞体外和体内生长环境下的抑制作用和其是否影响肝癌内FACL3、FACL4、FACL5和ER的水平,探讨其抗肿瘤作用的可能机制。
　　方法与结果：
　　1.体外培养肝癌SMMC-7721细胞株,以1、10、100、1000nmol/L的EB1089分别作用24、48和72h,采用MTT法测定EB1089对细胞的生长增殖的影响,结果显示,EB1089可以有效的抑制SMMC-7721细胞的生长,各组间差异有统计学意义,呈现出时间和剂量依赖性。
　　2.用1000nmol/L浓度的EB1089作用SMMC细胞24h和48h后,采用RT-PCR方法分别检测SMMC-7721细胞中FACL3、FACL4、FACL5和ERmRNA的表达变化。结果显示,EB1089作用24h和48h后,SMMC-7721细胞的FACL4和FACL5mRNA表达下降,ERmRNA表达上升,并呈时间依赖关系;而FACL3mRNA表达无明显改变。
　　3.用1000nmol/L浓度的EB1089作用SMMC细胞24h和48h后,采用Western-blot方法分别检测SMMC-7721细胞中FACL4、FACL5和ER蛋白的表达变化。结果显示,EB1089作用24h和48h后,SMMC-7721细胞的FACL4和FACL5蛋白表达均下降,ER蛋白表达上升,并呈时间依赖关系。
　　4.将肝癌SMMC-7721细胞悬液皮下注射于BALB/cNU/Nu裸鼠,建立人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型,随机分组后实验组分别给予0.5和1.0μg/(kg·d)腹腔注射,对照组给予等量乙醇溶液,不处死裸鼠情况下每5天计量肿瘤大小,绘制生长曲线图。结果显示,与对照组相比,两实验组均对裸鼠移植瘤有抑制作用,并呈剂量依赖关系。
　　结论：
　　EB1089对SMMC-7721细胞有明显的生长抑制作用,并具有时间、剂量依赖性。其作用机制可能通过抑制肝癌细胞内FACL4和FACL5的表达来实现。

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中文摘要

英文摘要

1. 引言

2. 材料和方法

2.1 实验材料

2.3 MTT比色法检测细胞增殖

2.4 半定量RT-PCR检测FACL3、FACL4、FACL5 mRNA表达水平

2.5 Western-blot检测FACL4、FACL5蛋白的表达水平

2.6 人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立

3. 结果

3.1 EB1089对SMMC-7721细胞生长增殖的影响

3.2 EB1089对SMMC-7721细胞FACL4基因表达的影响

3.3 EB1089对SMMC-7721细胞FACL5基因表达的影响

3.4 EB1089对SMMC-7721细胞FACL3基因表达的影响

3.5 EB1089对SMMC-7721细胞ER基因表达的影响

3.6 EB1089对SMMC-7721细胞FACL4蛋白表达的影响

3.7 EB1089对SMMC-7721细胞FACL5蛋白表达的影响

3.7 EB1089对SMMC-7721细胞ER蛋白表达的影响

3.7 皮下移植瘤成瘤及生长情况

4. 讨论

5. 结论

参考文献

附 录

致谢

综述