SIRT1调控软骨细胞自噬在骨关节炎中作用及机制的研究

摘要

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种以关节软骨的破坏、骨赘形成及关节间隙变窄为特征的退变性关节疾病。由于人们对其具体发病机制未完全认识，故尚难早期进行预防及治疗。目前骨关节炎发病机制研究焦点在关节软骨如何维持细胞和组织代谢的动态平衡，以及这些机制如何调节老化过程。近年来，发现细胞自噬参与了机体器官老化进程，通过溶酶体对自身受损结构和老化细胞器的吞噬降解过程，来影响细胞物质的合成、降解和重新利用以维持细胞代谢平衡。那么，软骨细胞自噬是否参与关节软骨退变以及自噬在骨关节炎病程中发挥怎样的作用，这些都是我们亟需解决的问题。SIRT1(沉默信息调节因子1)与各种衰老相关性疾病如神经退变性疾病、糖尿病、肿瘤、炎症等的发病密切相关。有研究表明， SIRT1通过对自噬相关蛋白去乙酰化修饰调节细胞自噬水平，但在骨关节炎中是否参与软骨老化及是否能够调节软骨细胞自噬水平，一直未能明确。因此，本研究首先探讨细胞自噬是否参与关节软骨退变以及软骨细胞自噬在骨关节炎中的可能角色，随后进一步阐明 SIRT1是否与软骨老化相关以及是否调节软骨细胞自噬，从而为SIRT1可能成为骨关节炎的治疗靶点提供理论依据。
　　本研究共分两部分，在第一部分中，为了研究软骨细胞自噬与软骨老化以及骨关节炎相关性，我们首先收集骨关节炎组、老年组以及青年组软骨组织，进行病理评分（Mankin评分），用免疫组化的方法检测自噬相关蛋白LC3、Beclin-1在软骨组织中表达情况，结果示：随着软骨老化自噬相关蛋白表达减少，但在骨关节炎中未见显著性下降。随后软骨细胞分离培养鉴定，体外观察软骨细胞很少发生自噬，并发现三组软骨细胞基础自噬没有显著性差异。为了模拟体内关节低氧环境，我们在体外低氧的环境条件下培养软骨细胞，检测低氧对软骨细胞自噬变化。将带有 GFP-LC3的质粒转入软骨细胞，采用GFP-LC3融合蛋白来示踪自噬形成，在激光共聚焦下观察细胞自噬过程，在骨关节炎和青年组软骨细胞中都发现大量自噬颗粒形成，而老年组软骨细胞自噬颗粒未见明显变化。随后Western blot结果显示：青年组和骨关节炎组软骨细胞在低氧环境中， LC3蛋白从 LC3-I向LC3-Ⅱ转换增加，提示自噬水平升高时，而在老年组中未见 LC3-Ⅱ/LC3-I显著增加。这些结果提示：细胞自噬随着软骨老化软骨细胞自噬水平下降，但在骨关节炎软骨中反而自噬增强。为了初步研究自噬在软骨老化及骨关节炎发病中作用，我们通过激活或抑制软骨细胞自噬，观察软骨细胞活性变化，我们采用MTT法检测细胞自噬对青年组、老年组及骨关节炎组细胞活性的影响，使用流式细胞术检测自噬对软骨细胞数量的影响。结果显示：在低氧环境中青年组软骨细胞自噬被激活，伴随细胞活性增强，而抑制骨关节炎组自噬后，细胞活性和数量增加。接着我们在电镜下发现并证实，在青年组软骨细胞发生自噬时，自噬体中细胞器形态正常被包裹，推断可能是一种保护性自噬，被包裹细胞器可能被再利用；而在骨关节炎软骨细胞发生自噬时，自噬体内含有大量空泡和细胞碎片，推断可能诱发自噬性死亡。这可能是提示自噬在青年组和骨关节炎组中对细胞活性作用相反的依据。因而，我们得出结论：自噬与软骨老化和骨关节炎相关，随着软骨老化自噬水平下降，但在骨关节炎中自噬水平升高，且自噬在软骨老化及骨关节炎中可能起到不同作用。在软骨老化前期是保护性作用，而在骨关节炎晚期导致软骨细胞死亡。
　　在第二部分工作中，为了研究SIRT1是否与骨关节炎软骨老化相关，采用免疫组化分析三组样本中SIRT1表达情况，结果示：老年组和骨关节炎组SIRT1蛋白均过低表达，随后我们在体外培养软骨细胞中用Western blot验证这一结果。为了研究SIRT1对软骨细胞自噬影响，我们采用SIRT1的激动剂（Resveratrol）和抑制剂（Sirtinol）改变软骨细胞内源性SIRT1的活性，并用SIRT1去乙酰化活性检测试剂盒检测SIRT1的活性，在改变SIRT1活性的条件下检测骨关节炎组和青年组软骨细胞的自噬能力变化，结果显示：SIRT1活性被抑制时，青年组软骨细胞自噬能力降低显著；SIRT1活性被激活时，老年组软骨细胞自噬能力增强，而骨关节炎组软骨细胞自噬能力减弱明显。接下来，通过采用自噬的激动剂或抑制剂来改变基础自噬水平，检测 SIRT1表达变化，结果在三组软骨细胞中，随着自噬能力变化，SIRT1蛋白表达均未见明显变化。因此，我们用免疫共沉淀法来确定SIRT1与自噬相关蛋白在细胞内是否相互作用。结果表明：在自噬相关蛋白 Atg7、LC3和Beclin-1中，仅Atg7与SIRT1发生相互作用。这也进一步证实我们的假设，SIRT1与自噬相关蛋白有直接作用关系，并SIRT1参与调节软骨细胞自噬。
　　综上所述，自噬在软骨细胞中发挥两种不同的作用，在软骨老化前期可能通过细胞自噬作用，使得损伤的细胞再修复利用，起到一种自噬性保护作用，随着软骨老化，自噬能力减弱，软骨修复能力也伴随下降；但在骨关节炎晚期，自噬可能启动了自噬性死亡机制，导致软骨细胞死亡加剧软骨破坏。在整个过程中， SIRT1参与软骨细胞自噬调节，在软骨老化前期能够增强软骨细胞自噬，通过调节软骨细胞自噬作用延缓软骨老化；而在骨关节炎晚期，通过减少软骨细胞自噬性死亡阻碍软骨进一步破坏。

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前言

第一部分 软骨细胞自噬在骨关节炎病程中作用的初步探讨

1 引言

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 实验方法

3 结果

3.1软骨组织病理评分及软骨细胞体外培养鉴定

3.2自噬相关蛋白LC3、Beclin-1在软骨组织中表达情况

3.3 体外培养的各组软骨细胞基础自噬水平差异

3.4低氧对体外培养软骨细胞自噬变化影响

3.5 雷帕霉素和3-MA对软骨细胞自噬影响

3.6 自噬调节对软骨细胞活性及细胞周期影响

3.7 青年组与骨关节炎组自噬软骨细胞超微结构差异

4 讨论

5 结论

第二部分 SIRT1参与骨关节炎软骨细胞自噬调节机制研究

1 引言

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 实验方法

3 结果

3.1 SIRT1在软骨组织及细胞中表达情况

3.2 SIRT1激活剂或抑制剂对软骨细胞的影响

3.3 调控SIRT1对软骨细胞自噬的影响

3.4 调控软骨细胞自噬对SIRT1表达影响

3.5 SIRT1与自噬相关蛋白相互作用

4 讨论

5 结论

参考文献

附录

致谢

综述及参考文献