呼吸道合胞病毒感染诱导氧化应激后通过Nrf2/ARE通路调节TLR7表达的研究

摘要

目的:探讨呼吸道合胞病毒(RSV)感染人肺上皮细胞(A549细胞)诱导氧化应激后,Toll样受体7(Toll-like receptor7,TLR7)的水平变化,初步研究氧化应激中Nrf2/ARE通路对TLR7活化及其主要信号分子表达的影响,探讨其所介导的抗炎作用和可能的调控机制,为临床治疗和预防RSV感染提供新的思路。
　　方法:以RSV感染体外培养的A549细胞,并分别给予Nrf2的抑制剂(Trigonelline,TRI)和Nrf2的激动剂(Butylated hydroxyanisole,BHA)进行处理,再以相同RSV感染,于感染后4h、8h、12h和24h不同时间点收集细胞和细胞培养上清,并以未感染病毒的A549细胞为正常对照组。①化学法检测细胞培养上清中活性氧指标?OH的含量变化;②硝酸还原酶法检测细胞培养上清中NO含量的变化;③用TRIzol提取细胞中RNA,通过半定量RT-PCR法检测TLR7、IL-6、TNF-α的mRNA转录水平变化;④酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞上清中IL-6、TNF-α的表达;⑤免疫印迹法(Western-blot)检测实验各组细胞中TLR7、Nrf2和HO-1的蛋白水平变化;⑥用MTT法检测各组细胞增殖情况。
　　结果:①感染组:随着感染时间点的延长?OH和NO的含量逐渐升高;在RSV感染不同时间点,可上调TLR7、IL-6、TNF-α基因转录水平表达,且其表达量与感染之间有时间依赖性关系;RSV感染不同时间点,细胞上清中IL-6、TNF-α的蛋白含量变化与感染之间有时间依赖性关系;细胞中TLR7、Nrf2和HO-1蛋白含量表达均与感染之间有时间依赖性关系;RS V感染组随时间点的延长细胞抑制率增加。
　　②TRI组:OH和NO的含量与感染组相比明显升高;TLR7、IL-6、TNF-α的mRNA表达比感染组相同时间点的表达量量相比明显升高,有统计学意义;细胞上清中的IL-6、TNF-α的含量比感染组相同时间点的表达量明显上调,有统计学意义;细胞中的TLR7、Nrf2、HO-1的蛋白的表达量都是上升的,但Nrf2、HO-1的蛋白表达虽有上调,仍比感染组同时间点的低;细胞抑制率与感染组相比表达上调不明显。
　　③BHA组:细胞中?OH和NO的含量与感染组相比是降低的;TLR7、IL-6和TNF-α的表达虽然随着感染时间点的延长呈现上升的趋势,但与感染组同时间点的相比低;细胞上清中IL-6、TNF-α的蛋白表达与mRNA的表达一致;细胞中的TLR7、Nrf2、HO-1的蛋白的表达都呈上升的趋势,但 TLR7的蛋白表达量与感染组同时间点相比降低,而Nrf2、HO-1的蛋白表达比感染组相同时间点的表达量则明显升高,且升高有统计学差异;细胞抑制率与感染组相比下调明显。
　　结论:RSV感染A549细胞可诱导氧化应激的产生并使TLR7及其下游分子的表达上调;在加入激动剂BHA处理后,TLR7及其下游分子的表达虽然随着感染时间点的延长也升高,但比感染组同时间点的低;在加入抑制剂Trigonelline后,TLR7及其下游分子的mRNA表达比感染组相同时间点表达量明显升高。以上数据表明,呼吸道合胞病毒感染活化TLR7的表达可能是通过氧化应激途径的Nrf2/ARE通路来调节的。

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1 前言

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

2.3 统计学处理

3 结果

3.1 病毒感染量的确定

3.2 RSV感染A549细胞不同组别?OH的含量变化

3.3 RSV感染A549细胞不同组别NO的含量变化

3.4 TLR7、IL-6、TNF-α在RSV感染组和BHA、Trigonelline干预组的mRNA转录水平变化

3.5 RSV感染A549细胞后各组的TNF-α和IL-6的ELISA结果

3.6 RSV感染A549细胞后各组TLR7、Nrf2和HO-1的Western Blot结果

3.7 RSV感染A549细胞后各组MTT法检测细胞抑制情况结果

4 讨论

5 结论

参考文献

附录

致谢

氧化应激—治疗呼吸道合胞病毒感染的新途径