母鼠围生期双酚A暴露对子代Th17细胞的影响及维生素D补充的改善效应

摘要

研究背景：人工合成化学物双酚A(Bisphenol A,BPA)是合成聚碳酸酯和环氧树脂的主要单体,工业上广泛应用于奶瓶、食品和饮料包装材料等人类日常生活用品,医疗设备以及热敏纸等的制造。随着需求量的逐渐增加,BPA已经成为世界上高产量化学物之一。在酸性环境或加热情况下,BPA会从这些物品中释放出来,经消化道、呼吸道和皮肤等多种途径进入人体,人群调查显示人类已广泛暴露于环境 BPA。作为一种已公认的环境内分泌干扰化学物（environmental endocrine disrupting chemical,EDC),BPA具有弱雌激素活性,可以对包括内分泌、神经行为、生殖发育等产生不良影响,对人类健康造成极大威胁。近年来,有研究显示围生期母体 BPA暴露对子代出生后免疫功能有明显影响,如改变CD4+T细胞亚群辅助性T细胞(help T cell,Th)1和Th2的平衡,减少调节性T细胞(T regulation cell,Treg cell)数量等。Th17细胞是近年来新发现的一类CD4+T细胞亚群,通过分泌促炎细胞因子IL-17等发挥作用,参与炎症、自身免疫性疾病和肿瘤等的发生和发展。然而,到目前为止,围生期 BPA暴露对出生后子代Th17细胞有何影响尚无报道。
　　维生素D是机体生长发育所必需的一类维生素,研究显示维生素D在免疫应答中也发挥重要的调节作用,可以抑制Th17细胞的增殖和分化。维生素D对BPA诱导的Th17改变有何调节作用目前还不清楚,但这对BPA免疫危害的防治具有重要意义。
　　研究目的：通过检测围生期饮水摄入不同剂量BPA母鼠所生子代出生后不同时期脾脏 Th17细胞数量、特异性转录因子维甲酸相关孤儿核受体(retinoic acid related orphan receptor gamma t,RORγt) mRNA水平和血清中白介素(interleukin,IL)-6、IL-17、IL-21、IL-23、转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)含量,探讨母鼠围生期BPA暴露对子代出生后Th17细胞的影响。通过检测围生期饮水暴露上述高剂量 BPA且腹腔注射补充不同剂量维生素 D的母鼠所生子代出生后不同时期上述指标的改变,探讨维生素 D补充对母鼠围生期 BPA暴露所致子代Th17细胞影响的改善效应。
　　研究方法：选用8周龄ICR雌鼠和9周龄ICR雄鼠饲养于清洁级动物房,适应性饲养1周后,交配查到阴栓确认为受孕。将孕鼠分为空白对照组、溶剂对照组、10 nM BPA组、100 nM BPA组、1000 nM BPA组、1000nM BPA+0.25μg/kg维生素D组、1000nM BPA+1μg/kg维生素D组、1000nM BPA+4μg/kg维生素D组。母鼠自孕第一天(gestation day0,GD0)至断乳(postnatal day21,PND21)每天经饮水暴露BPA,同时每天经腹腔注射给予BPA高剂量组母鼠一次维生素D。在子代PND21、PND42时,采集外周血,酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清IL-6、IL-17、IL-21、IL-23、TGF-β含量;处死小鼠,雌雄各半,无菌取脾脏,采用流式细胞仪(flow cytometry,FCM)检测脾脏Th17细胞数量,并以CD4+细胞中IL-17+细胞所占的比例表示。实时荧光定量聚合酶链反应（real time-quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测Th17细胞特异转录因子RORγt mRNA表达水平,用SPSS13.0统计软件包对实验结果进行统计分析。
　　结果：
　　1.一般情况试验期间各组孕鼠一般情况良好,在孕期未观察到死亡、流产、死胎和死产现象。孕期各组母鼠体重增长差异无统计学意义;出生后至断乳时各组子鼠的平均窝仔数、平均体重没有统计学差异;PND42时 BPA高剂量组体重高于空白对照组(P<0.05),断乳后其余各组间体重均无统计学意义。
　　2.母鼠围生期饮水摄入BPA对子代Th17细胞的影响
　　2.1.对子代Th17细胞分化等相关指标表达的影响
　　PND21和PND42时,空白对照组和溶剂对照组相比,子鼠脾脏Th17数量和RORγt mRNA水平、血清IL-6、TGF-β和IL-23水平差异均没有统计学意义;除血清TGF-β水平外,其他指标均随BPA暴露剂量的增加而升高;与对照组相比,除血清 TGF-β水平外,BPA中、高剂量组其他指标均升高(P<0.05,P<0.01)。PND42时,除血清TGF-β水平外,BPA中、高剂量组其他指标较PND21时有所下降,BPA低剂量组RORγt mRNA水平也较PND21时有所降低,但差异均无统计学意义。相关性分析显示,脾脏Th17细胞数量与RORγt mRNA表达水平、血清中IL-6、IL-23含量均存在显著正相关(r=0.771,0.818,0.795,P<0.05)。
　　2.2.对子代Th17细胞特征性细胞因子分泌的影响
　　在PND21和PND42时,两个对照组血清IL-17水平差异没有统计学意义;血清IL-17水平随BPA剂量的增加而升高。PND21时,BPA中剂量和高剂量组IL-17水平显著高于对照组(P<0.01);PND42时,BPA中剂量组高于对照组(P<0.05),BPA高剂量组明显高于对照组(P<0.01)。PND42时各BPA暴露组血清IL-17水平较PND21时有所降低,但差异没有统计学意义。相关性分析显示,脾脏Th17细胞数量与血清中IL-17含量均存在显著正相关(r=0.855,P<0.05)。
　　2.3.对子代Th17细胞扩增相关细胞因子分泌的影响
　　在PND21和PND42时,两个对照组血清IL-21水平差异没有统计学意义;血清IL-21水平随BPA剂量的增加而升高。PND21时,BPA低剂量组血清IL-21水平高于对照组(P<0.05),中剂量和高剂量组血清 IL-21水平显著高于对照组(P<0.01);PND42时,BPA中、高剂量组血清IL-21水平明显高于对照组(P<0.05)。PND42时,BPA各组血清IL-21水平较PND21时有所降低,但差异没有统计学意义。相关性分析显示,脾脏Th17细胞数量与血清中IL-21含量均存在显著正相关(r=0.709,P<0.05)。
　　3.维生素D补充对母鼠围生期BPA暴露所致子代Th17细胞相关指标增加的影响
　　3.1.对子代Th17细胞分化等相关指标表达增强的影响
　　母鼠腹腔注射不同剂量维生素D对围生期1000nM BPA暴露引起的子代脾脏Th17细胞数量和RORγt mRNA表达水平、血清IL-6和IL-23水平上升具有抑制作用,且呈现一定的剂量反应关系。在PND21和PND42时,与1000nM BPA组结论
　　比较,维生素D中、高剂量补充组上述四个指标明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01);与空白对照组相比,除PND42时维生素D中剂量组IL-23外,维生素D低、中剂量补充组上述指标明显升高,差异有统计学意义(P<0.01,P<0.05),仅维生素D高剂量补充组升高不明显,差异没有统计学意义。腹腔注射不同剂量维生素D对围生期1000nM BPA暴露母鼠所生子代PND21和PND42时TGF-β水平影响不明显,各组之间差异没有统计学意义。
　　3.2.对子代Th17细胞特征性细胞因子分泌增强的影响
　　腹腔注射不同剂量维生素D对母鼠围生期1000nM BPA暴露引起的IL-17水平上升具有抑制作用,且呈现一定的剂量反应关系。PND21时,与1000nM BPA组比较,维生素D中、高剂量补充组IL-17水平下降,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01);与对照组相比,维生素D低剂量补充组IL-17水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.01);与空白对照组相比,维生素D中剂量补充组升高(P<0.05);而与对照组相比,维生素D高剂量补充组IL-17水平升高不明显,差异已没有统计学意义。PND42时,与1000nM BPA组比较,维生素D中、高剂量补充组IL-17水平明显下降,差异具有统计学差异(P<0.01);与对照组相比,维生素D低剂量补充组IL-17水平升高(P<0.05),而维生素D中、高剂量补充组IL-17水平升高不明显,差异已没有统计学意义。
　　3.3.对子代Th17细胞扩增相关细胞因子分泌增强的影响
　　腹腔注射不同剂量维生素D对母鼠围生期1000nM BPA暴露引起的子代血清IL-21水平上升具有抑制作用,且呈现一定的剂量反应关系。PND21时,维生素D中剂量组和维生素D高剂量组两指标高于BPA高剂量组(P<0.05),且维生素D高剂量组更加明显(P<0.01)。维生素D低剂量组和维生素D中剂量组两指标显著高于空白对照组(P<0.01,P<0.05)。PND42时,维生素D低剂量组IL-21水平显著高于空白对照组(P<0.01),维生素D中剂量组IL-21水平高于空白对照组(P<0.05),维生素D各组IL-21水平与BPA高剂量组差异没有统计学意义。
　　结论：
　　1.母鼠围生期经水摄入BPA对子代出生后不同时期Th17细胞有显著的影响,导致Th17细胞数量升高、特异性转录因子RORγt mRNA表达上调、血清Th17细胞分泌和功能相关的细胞因子IL-6、IL-17、IL-21、IL-23含量增高。
　　2.维生素D补充对母鼠围生期BPA暴露引起的子代Th17细胞改变具有显著的影响,维生素D可抑制母鼠BPA暴露所致子代Th17细胞上述指标的升高。
　　3.BPA可能通过促进Th17细胞增殖和分化的细胞因子分泌,上调特异性转录因子表达,从而增加Th17细胞的数量和其分泌的细胞因子水平。

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中文摘要

英文摘要

1 引言

2 材料与方法

2.1 试剂和仪器

2.2 动物饲养及分组

2.3 技术路线图

2.4 标本采集

2.5 小鼠Th17细胞测定

2.6 统计分析

3 结果

3.1 一般情况

3.2 母鼠围生期饮水摄入BPA对子代出生后Th17细胞的影响

3.3 维生素D补充对母鼠围生期1000 nM BPA暴露所致子代Th17细胞增加的影响

4 讨论

5 结论

参考文献

个 人 简 历

致谢

综述