人乳头瘤病毒16型全基因组克隆及其表达载体构建

摘要

目的：人乳头瘤病毒(HPV)是一种小型无包膜、双链环状DNA病毒,其分型依据是根据L1基因的序列相似性制定,L1基因的序列相似性<90％为新的型别,相似性在90%~98%之间为同一型别的不同亚型,相似性>98%为同一型别的不同变异株。全世界约70%的宫颈癌和高危型HPV16、18型直接相关,大约25%的口腔癌与高危型HPV有关,安徽省合肥地区宫颈癌发生率与感染HPV16具有较高的相关性。本研究通过克隆安徽省人乳头状瘤病毒16型(human papillomavirus type16,HPV16)全基因组,分析HPV16全基因组序列,并以全基因组序列信息为基础构建含HPV16全基因组的表达载体,为建立HPV16转染体系打下基础。
　　方法：(1) HPV16全基因组克隆:收集5例安徽省宫颈癌病理组织标本并提取总DNA,在GenBank中下载不同的HPV16全基因组序列并用DNAStar软件进行序列比对,将HPV16全基因组分成4个区段,即HPV-A、HPV-B、HPV-C和HPV-D,分别设计4对特异性引物,分段克隆HPV16全基因组,测序后进行序列拼接及核苷酸序列分析。(2)构建环化的HPV16全基因组:对含有HPV16的总DNA进行滚环扩增,回收1拷贝线性HPV16全基因组,再用连接酶使其自环化,BamHI位于片段HPV-A内,PCR扩增环化HPV16中的片段HPV-A,验证是否构建成功。(3)构建HPV16全基因组表达载体:同尾酶 BamHI和BglII双酶切表达载体pLEGFP-N1,1拷贝线性HPV16插入双酶切后的载体pLEGFP-N1,命名pG/1H;扩增HPV16基因组中6152-120 bp的片段(相当于0.2拷贝HPV16基因组),改造载体pLEGFP-N1的酶切位点,将0.2拷贝HPV16插入质粒pG/1H,命名pG/1.2H,测序验证PCR保真性,酶切验证构建是否成功。
　　结果：(1)检测到1个宫颈癌病理样本中含有HPV16并获得全基因组序列,序列全长7906 nts(GenBank登录号:KC935953)。序列比对发现,安徽 HPV16(HPV16-Anhui)与HPV16-TH和HPV16-JP的全基因组核苷酸序列相似性最高,达99.5%。系统关系树分析显示,HPV16-Anhui与其他7个HPV16型聚成1个单独的分支。(2)环化的HPV16 DNA电泳速度与线性HPV16有明显差异,从环化的HPV16中成功扩增出片段HPV-A,说明构建成功。(3) BamHI和HindIII双酶切pG/1.2H,得到14797 bp(其中载体pLEGFP-N16891 bp,1拷贝HPV167906 bp)和1857 bp(0.2拷贝HPV16)2个条带,验证HPV16全基因组表达载体构建成功。
　　结论：(1)获得安徽省首例HPV16全基因组核苷酸序列,HPV16-Anhui与不同地区HPV16亲缘关系均较近且基因组变异性较小。本研究对进一步了解安徽省甚至华东地区 HPV16病毒基因组变异和进化规律具有重要意义。(2)成功构建含 HPV16全基因组的表达载体和环化的HPV16全基因组,为HPV16完整基因组转染细胞的体系奠定基础。

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1. 前言

2. 材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 样本来源

2.1.2 仪器设备

2.1.3 载体

2.1.4 工具酶及生化试剂

2.1.5 分析软件

2.2 试验方法

2.2.1 总DNA提取

2.2.2 HPV16全基因组克隆

2.2.3 构建环化的HPV16全基因组

2.2.4 含HPV16全基因组表达载体的构建

3 结果

3.1 安徽HPV16全基因组结构

3.1.1 安徽HPV16片段HPV-A的克隆和测序

3.1.2 安徽HPV16片段HPV-B、HPV-C和HPV-D的克隆和测序

3.1.3 安徽HPV16全基因组结构特征

3.2 序列分析结果

3.3 成功构建环化HPV16

3.4 HPV16全基因组表达载体构建

4. 讨论

5. 结论

参考文献

附录

致谢

综述