肠道病毒71型串联表位疫苗的分子设计与免疫效果评价

摘要

肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71)是小RNA病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属的重要成员,主要感染5岁以下儿童,是导致手足口病(Hand-Foot-Mouse)的主要病原体,广泛流行于亚洲太平洋地区。该病毒可引起类似于脊髓灰质炎的神经系统症状,是一种重要的新发嗜神经病毒。目前临床上并无针对EV71病毒的有效疫苗和特效药物,疫苗是控制EV71感染的有效手段,许多疫苗候选株包括甲醛灭活病毒疫苗、减毒活疫苗、病毒样颗粒疫苗、DNA疫苗以及亚单位疫苗都已取得了很好的实验结果,但是缺乏有效的临床试验数据。
　　EV71病毒为单股正链RNA病毒,长度约7500bp,包含单一开放阅读框(ORF),ORF首先编码一个多聚蛋白,然后多聚蛋白被切割成VP1、VP2、VP3和VP4四个结构蛋白和若干个非结构蛋白。在病毒的结构蛋白中,VP1、VP2和VP3暴露于病毒颗粒表面,诱导机体产生免疫应答,决定了病毒的免疫原性,而VP4则完全位于病毒粒子的内部,与病毒的复制翻译有关。目前,许多EV71的线性中和表位已经确定,我们利用软件分析和序列比对筛选出在EV71不同基因亚型之间具有高度保守性的三个表位,它们分别是 VP1蛋白上的SP55(氨基酸位置163-177)和SP70(氨基酸位置208-222)以及VP2蛋白上的SP28(氨基酸位置136-150),实验证明它们均可诱导小鼠产生针对EV71病毒的特异性中和抗体,是多表位疫苗的理想靶标。
　　在本研究中,我们首先构建了EV71多个串联线性中和表位(SP55-SP70-SP28)的原核表达载体,随后对其进行诱导表达,获得了 EV71多表位串联重组蛋白mTLNE。将纯化后的mTLNE免疫小鼠,从体液和细胞免疫两个方面,系统评价mTLNE的免疫效果,并进一步观察免疫血清对小鼠的体内保护效果,明确了mTLNE作为疫苗的可行性。
　　1.EV71串联线性中和表位mTLNE的设计与构建;我们首先对EV71 B细胞表位的保守性进行分析,选择SP55、SP70和SP28三个线性中和表位为靶标,再基于 EV71国内流行株 AH08/06（GenBank:HQ611148)上三个线性中和表位的的基因序列以及 pET32a上的限制性酶切位点设计引物,为使三个表位能够独立的展示各自的抗原表位,在各表位之间插入蛋白Linker序列-(G4S)3。
　　为同时表达上述三个表位,我们利用重叠PCR技术扩增三个串联表位的基因序列,然后将该PCR产物克隆到pET32a载体中,构建包含mTLNE基因的重组质粒,最后对重组质粒进行核酸序列测定。结果表明成功构建了包含mTLNE基因的原核表达载体。
　　2.重组蛋白的表达、纯化和鉴定;将重组质粒转化BL21感受态细胞,用IPTG诱导表达,采用SDS-PAGE的方法进行鉴定,结果显示:重组质粒转化菌经IPTG诱导后在30KD附近出现了一条带,与预期大小一致,说明重组质粒可在原核细胞中表达目的蛋白。随后又对诱导菌进行超声破碎处理,同样采用 SDS-PAGE鉴定,结果显示:预期大小的条带主要出现在诱导菌的上清中,证明mTLNE为可溶性蛋白。
　　随后对 mTLNE蛋白进行大量表达,用可溶性蛋白试剂盒纯化回收,并用SDS-PAGE、Western Blotting、ELISA等方法鉴定纯化的蛋白,结果表明:获得了mTLNE蛋白,其纯度大于99％,并且mTLNE蛋白可与EV71病毒免疫的鼠血清和兔血清反应,说明重组蛋白mTLNE具有良好的抗原性。
　　3:重组蛋白mTLNE的免疫原性与免疫保护性分析;将mTLNE蛋白免疫6周龄的BABL/c雌鼠(Trx蛋白为阴性对照),每隔两周加强免疫一次,共免疫三次。采用ELISA的方法测定免疫血清的IgG效价及亚型,结果显示:mTLNE初次免疫后即能够诱导小鼠体内产生EV71病毒特异性的IgG抗体,且随着免疫的加强,IgG效价逐渐升高,第二次加强免疫之后,IgG效价可以达到1:3191,lgG分型显示mTLNE诱导小鼠产生的lgG亚型主要为IgG1。采用TCID50的方法进行中和滴度的测定,结果显示第二次加强免疫后,免疫血清的中和抗体效价可以达到1:50。采用ELISPOT的方法对脾细胞分泌的细胞因子进行测定。结果显示mTLNE免疫小鼠后诱导其体内产生的细胞因子以IL-4和IL-6为主。随后又测定了免疫血清对1日龄BALB/c乳鼠的体内保护效果。结果显示:注射mTLNE免疫血清的小鼠全部存活且没有发病症状,而注射Trx免疫血清和PBS的小鼠在第5天开始发病,10天之内全部死亡,说明mTLNE的免疫血清可以有效的保护新生乳鼠免受EV71病毒的攻击。
　　本研究表明,在原核细胞中表达的EV71串联多表位疫苗mTLNE,可有效诱导小鼠产生较强的体液和细胞免疫应答,而且免疫血清能够被动保护乳鼠免受致死剂量的EV71攻击。表明该疫苗可作为一种潜在的EV71疫苗候选株,以上结果为研制EV71新型疫苗提供了新思路。

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前言

第一部分 EV71串联线性中和表位mTLNE的设计与构建

1. 引言

2. 材料和方法

3. 结果

4. 讨论

第二部分 重组蛋白mTLNE的表达、纯化和鉴定

1. 引言

2. 材料和方法

3. 结果

4. 讨论

第三部分 重组蛋白mTLNE的免疫血清的免疫原性与免疫保护性分析

1. 引言

2. 材料和方法

3. 结果

4．讨论

结论

参考文献

附录：

个人简历

致谢

综述及参考文献