人肾小管上皮细胞内SIGIRR对NF-κB活化的调控和NF-κB对SIGIRR的反馈调控以及SIGIRR调控EMT发生机制的初步研究

摘要

背景和目的：狼疮肾炎（LN）是系统性红斑狼疮(SLE)最常见的并发症之一，且LN的严重程度对SLE患者死亡率及预期寿命有显著影响。目前为止LN的病因和发病机制尚未明确阐明。目前越来越多的研究报道 Toll样受体/白细胞介素-1受体(TLR/IL-1R)信号通路参与SLE的发病机制。单一免疫球蛋白白细胞介素1受体相关蛋白(SIGIRR)，又称为Toll/interleukin-1受体8(TIR8)，是TLR/IL-1R家族的成员，越来越多的证据表明SIGIRR对TLR/IL-1R信号通路具有负调控作用，并有可能成为SLE治疗的潜在靶点，但是何种机制调控SIGIRR的表达，目前还不清楚。核转录因子NF-κB（NF-κB）是一类功能广泛的核转录调控元件，被激活后可以调控多种基因的转录和翻译。在LN等免疫介导的肾脏疾病中TLR/IL-1R-NF-κB过度活化，参与调控炎性介质及细胞因子的产生。临床上很多药物的作用机制也是干预NF-κB的活化而控制疾病的发展。因此我们将在人肾小管上皮细胞内探讨SIGIRR可以调控NF-κB(p65)的过度活化和活化的NF-κB(p65)是否反过来又可以调控 SIGIRR的表达，控制自我的过度活化使免疫保持平衡。另外在LN等慢性肾脏疾病进展至终末肾功能衰竭的进程中肾间质纤维化（RIF)发挥着重要作用，其中肾小管上皮-间充质细胞转分化(EMT)，也称为肾小管上皮细胞肌成纤维细胞转化，是RIF发生的关键事件。研究发现 LN患者肾脏组织中过度表达活化的白介素lβ(IL-1β)可以通过TLR/IL-1R信号通路诱导肾小管上皮细胞转化为肌成纤维细胞，在 RIF的形成中发挥重要作用，而 SIGIRR对该信号通路具有负调控作用，因此我们将探讨是否SIGIRR可以经TLR/IL-1R-NF-κB信号通路阻断IL-1β诱导的信号活化而改善人肾小管上皮细胞的转分化的发生。
　　方法：第一部分：针对SIGIRR基因的有效靶点设计 shRNA序列，与GV248-GFP-Puro慢病毒载体连接产生重组体(GV248-GFP-Puro-shSIGIRR)。将测序验证正确的重组体与包装质粒(pMDL、pRev和pVSVG)共转染293T细胞进行病毒包装，收集病毒并感染HKC细胞。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和western blot法分析检测HKC细胞中SIGIRR干涉效率。应用IL-1β刺激成功敲低SIGIRR的HKC细胞及对照细胞，western blot检测其下游核转录因子NF-κB(p65)的磷酸化水平，荧光定量PCR分析单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和正常T细胞表达和分泌的活化调节蛋白(RANTES）mRNA水平。第二部分：该部分研究以野生型HKC为模型，构建p65稳定下调的HKC细胞系（HKC/shp65），经逆转录PCR（RT-PCR）、western blot和免疫荧光法检测SIGIRR表达情况。在线预测SIGIRR启动子区域NF-κB(p65)的结合位点，以野生型HKC细胞为模版，染色质免疫沉淀技术(ChIP）初步验证NF-κB(p65)可以结合至SIGIRR启动子区域。提取人全基因组DNA，PCR方法调取SIGIRR启动子序列连接至pGL3-Basic荧光素酶报告基因载体上。酶切和测序验证成功构建，之后把NF-κB(p65)与SIGIRR启动子DNA结合的序列进行定点突变构建突变载体并测序验证，再经荧光素酶报告基因实验间接的进一步验证NF-κB(p65)可结合调控SIGIRR的表达。第三部分：将人SIGIRR cDNA片段连接至逆转录病毒载体pLNCX2-G418，经PT67细胞包装成病毒感染HKC细胞，qRT-PCR和western blot证实SIGIRR过表达HKC细胞（HKC/SIGIRR）成功构建。HKC/SIGIRR细胞及对照细胞经 IL-1β诱导后，倒置显微镜下观察细胞形态，western blot和免疫荧光检测EMT相关的分子标记（E-cadherin和Vimentin）变化，划痕实验和Transwell assay检测细胞迁移能力。提取核蛋白后 western blot检测NF-κB（p-p65）表达，qRT-PCR法检测转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β) mRNA表达。
　　结果：第一部分：成功构建重组慢病毒载体GV248-GFP-Puro-shSIGIRR。qRT-PCR和western blot均证实在HKC细胞中成功敲低SIGIRR的表达。此外，IL-1β刺激后，与对照细胞相比，敲低SIGIRR的HKC细胞(HKC/shSIGIRR)的p65磷酸化水平上调，MCP-1和RANTES mRNA表达水平升高。第二部分：成功构建p65稳定干涉的HKC细胞（HKC/shp65），并发现干涉p65基因后，SIGIRR蛋白表达量下调。在线预测发现在SIGIRR启动子上游存在p65的结合位点。CHIP方法证实p65可以结合在SIGIRR启动子区。成功构建pGL3-SIGIRR-Luc和突变载体，经荧光素酶实验再次证明p65可以结合至SIGIRR启动子区并可以调控表达。第三部分：成功构建pLNCX2-G418-SIGIRR过表达载体，qRT-PCR和western blot均证实在HKC细胞中SIGIRR成功过表达。此外发现与SIGIRR过表达组相比较，经IL-1β诱导后对照组细胞呈梭形改变，上皮细胞标记分子上皮型钙黏蛋白E-cadherin表达减弱，间充质细胞标记分子波形纤维蛋白Vimentin表达增强，细胞的迁移能力亦增强。发现该作用是通过SIGIRR影响IL-1β诱导的TLR/IL-1R-NF-κB信号通路的激活减少TGF-β的产生实现的。
　　结论：第一部分实验结果提示 SIGIRR可对 IL-1β诱导的人肾小管上皮细胞内TLR/IL-1R信号通路活化起到“刹车”作用，并且在第二部分发现TLR/IL-1R信号通路下游靶分子 NF-κB（p65），活化后可反过来调控 SIGIRR的表达而达到免疫平衡。在第三部分中发现SIGIRR作为一抑制分子，可以经TLR/IL-1R-NF-κB信号通路调控IL-1β诱导的人肾小管上皮细胞的转分化。

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第一部分：稳定敲低SIGIRR的人肾小管上皮细胞的构建及其初步功能研究

1. 前言

2．材料与方法

3. 结果

4. 讨论

5.结论

第二部分：核转录因子NF-κB调节肾小管上皮细胞SIGIRR表达机制的探讨

1. 前言

2．材料与方法

3. 结果

4. 讨论

5. 结论

第三部分：SIGIRR基于TLR/IL-1R-NF-κB信号通路调控IL-1β诱导的人肾小管上皮-间充质细胞转分化机制的研究

1. 前言

2．材料与方法

3. 结果

4 讨论

5. 结论

本课题进一步的设想：

参考文献

附录：个人简历

致谢

综述:狼疮性肾炎治疗的潜在靶分子SIGIRR