EZH2在肝纤维化中的作用及其部分机制研究

摘要

肝纤维化是所有慢性肝脏疾病形成的共同病理反应过程，活化的肝星状细胞分泌的细胞外基质（ECM）的增多是肝脏纤维化发病的最主要特征之一，肝星状细胞（HSC）的增殖和活化是肝脏纤维化形成的关键环节，抑制HSC的增殖和活化成为抗肝纤维化治疗的重要手段之一。研究表明组蛋白甲基化在HSC的增殖活化过程中起到了很重要的作用，但具体机制尚不明确。为了更进一步地探讨组蛋白甲基化在肝纤维化形成过程中的重要作用及其机制，通过在体与离体两个不同的角度，首先观察在肝纤维化组织中和活化的肝星状细胞中与组蛋白甲基化有关的转移酶的表达变化情况，再观察组蛋白甲基化有关的转移酶对HSC增殖和活化的影响，最后更深一步地探讨了其部分作用机制。本文主要研究内容包括下面四个部分：
　　1. CCl4诱导的大鼠肝脏组织中EZH2和Dkk1的表达变化。
　　将40只大鼠分为正常组10只和模型组30只，取CCl4进行腹腔注射用以建立大鼠肝纤维化的模型。模型组的大鼠以50％CCl4植物油溶液(1ml/kg)进行腹腔注射，每周注射2次，共注射12周；正常组以相同剂量植物油进行腹腔注射，同样每周注射2次，共注射12周。在12周结束后，处死实验大鼠并获取肝脏组织进行H&E染色和Masson染色的检测，并应用Real-time PCR、Western Blot法和免疫组化法检测分析α-SMA、EZH2和Dkk1在大鼠肝组织中的表达变化。实验的结果发现，EZH2在肝脏纤维化形成过程中表达升高，Dkk1在肝脏纤维化形成过程中表达降低。
　　2. TGF-β1诱导的HSC-T6细胞中EZH2和Dkk1的表达变化。
　　实验研究的对象选取HSC-T6细胞，应用10ng/ml TGF-?1分别刺激细胞24h和48h后，收取细胞，提取RNA和蛋白，应用Real-time PCR和Western Blot法检测分析在TGF-β1刺激的HSC-T6细胞中α-SMA、EZH2和Dkk1表达变化情况。实验结果发现，在TGF-β1诱导活化的HSC-T6细胞中EZH2表达升高，Dkk1表达降低。
　　3.抑制EZH2的表达可以阻抑TGF-β1诱导的HSC-T6细胞的增殖和活化。
　　1）实验研究的对象选取HSC-T6细胞，应用MTT的方法检测EZH2的抑制剂DZNep对TGF-β1诱导的HSC-T6细胞增殖活性的影响。实验分为对照组、模型组、DZNep作用6h组、DZNep作用12h组、DZNep作用24h组和DZNep作用48h组。实验结果发现，DZNep可以抑制由TGF-β1诱导的HSC-T6细胞的增殖，抑制程度和DZNep浓度有关。实验研究的对象选取HSC-T6细胞，实验可分组为对照组、模型组、阴性对照组和EZH2-siRNA实验组。同样应用MTT法检测 si-EZH2对 TGF-β1诱导的 HSC-T6细胞增殖活性的影响。实验结果发现，si-EZH2可以抑制由TGF-β1诱导的HSC-T6细胞的增殖。以上结果说明，DZNep和si-EZH2导致的EZH2的表达沉默都可以抑制由TGF-β1诱导的HSC-T6细胞的增殖。
　　2）实验研究的对象选取HSC-T6细胞，应用10ng/ml TGF-?1刺激HSC-T6细胞30min后，加入1ng/ml的DZNep温育24h，采用Real-time PCR方法检测分析α-SMA和EZH2的mRNA表达变化；采用Western Blot法检测分析α-SMA和EZH2的蛋白表达变化情况。实验结果发现，DZNep可以抑制由TGF-β1诱导的HSC-T6细胞的活化。同样实验研究的对象选取HSC-T6细胞，依据EZH2基因序列设计与合成EZH2的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)即si-EZH2，应用脂质体LipofectamineTM2000转染到HSC-T6细胞中。采用Real-time PCR方法检测分析α-SMA和EZH2的 mRNA表达变化；采用Western Blot法检测分析α-SMA和EZH2的蛋白表达变化情况。实验结果发现，si-EZH2可以抑制由TGF-β1诱导的HSC-T6细胞的活化。以上结果说明，DZNep和si-EZH2导致的EZH2的表达沉默都可以抑制由TGF-β1诱导的HSC-T6细胞的活化。
　　4.抑制EZH2表达后HSCs增殖活化被影响的部分机制研究。
　　1）实验研究的对象选取 HSC-T6细胞，依据 Dkk1的基因序列设计与合成Dkk1的小干扰RNA，应用脂质体LipofectamineTM2000转染到HSC-T6细胞内。采用Real-time PCR方法检测分析Dkk1和α-SMA的mRNA表达变化情况；采用Western Blot法检测分析Dkk1、β-catenin、C-myc、CyclinD1和α-SMA的蛋白表达变化情况。实验结果发现，沉默Dkk1促进了由TGF-β1诱导的HSC-T6细胞的增殖和活化。同样实验研究的对象选取 HSC-T6细胞，如前面所述应用DZNep和si-EZH2抑制EZH2的表达，采用Real-time PCR方法检测分析Dkk1的mRNA表达变化情况；采用Western Blot法检测分析Dkk1和H3K27me3的蛋白表达变化情况。实验结果发现，Dkk1的表达变化受到EZH2的调控。同样实验研究的对象选取HSC-T6细胞，如前面所述应用DZNep和si-EZH2抑制EZH2的表达，采用Western Blot法检测分析β-catenin、C-myc和CyclinD1的蛋白表达变化情况。实验结果发现，EZH2介导的Dkk1的表达下降导致了Wnt/β-catenin通路的激活。同样实验研究的对象选取HSC-T6细胞，如前面所述采用DZNep抑制EZH2的表达，采用si-Dkk1抑制Dkk1的表达，同时采用DZNep抑制EZH2的表达和采用si-Dkk1抑制Dkk1的表达。Real-time PCR方法检测分析Dkk1和α-SMA的mRNA表达变化情况；Western Blot法检测分析Dkk1、β-catenin、C-myc、CyclinD1和α-SMA的蛋白表达变化。实验结果发现，Dkk1在EZH2介导的Wnt/β-catenin通路的激活中起到了重要的作用。以上所有实验说明，EZH2通过抑制Dkk1的表达进而激活了Wnt/β-catenin通路从而最终促进了HSC的增殖和活化。
　　2）实验研究的对象选取HSC-T6细胞，如前面所述的采用DZNep和si-EZH2抑制EZH2的表达，采用Western Blot法检测分析α-SMA、p-ERK和p-AKT的蛋白表达变化情况。实验结果发现，EZH2可以激活ERK和PI3K/AKT通路进而促进HSC的增殖和活化。

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英文摘要

1 前言

2 实验材料

2.1 实验动物

2.2 药品与试剂

2.3 仪器与设备

2.4 图象分析软件

3 实验方法

3.1 实验动物的处理和模型的建立

3.2 大鼠肝星状细胞培养

3.3 肝组织病理学检测

3.4 免疫组织化学检测

3.5 MTT增殖实验

3.6 肝脏组织与肝星状细胞总RNA的提取和逆转录

3.7 PCR扩增实验

3.8 Western Blot实验

3.9 siRNA实验

3.10统计学处理

4 实验结果

4.1 CCl4诱导的大鼠肝组织中EZH2和Dkk1的表达变化

4.2 TGF-β1诱导的HSC-T6细胞中EZH2和Dkk1的表达变化

4.3 EZH2对TGF-β1诱导的HSC-T6细胞增殖活化的影响

4.4 EZH2影响HSCs增殖活化的部分机制研究

5讨论

6 结论

参考文献

附录

致谢

综述: 组蛋白的甲基转移酶和组蛋白的去甲基转移酶与肝细胞癌