结核杆菌脂质抗原对人外周血单个核细胞的作用

摘要

背景及目的：结核病（TB）是我们人类已知的最古老的传染病之一，结核分枝杆菌（M.tb）是主要致病因素，所以寻找有效的抗 M.tb药物或者疫苗一直是各国研究的重点之一。但是，至今其预防和治疗仍不尽人意。虽然，现有的商业疫苗已经有了卡介苗（BCG），其对于儿童感染的 TB预防是有效的，尤其是较严重类型TB（如结核性脑膜炎、粟粒性结核病），但是其对保护成人肺结核方面缺乏稳定性。目前对M.tb的研究主要是运用M.tb的不同成分或者其自身分泌蛋白作为抗原，诱导不同的免疫细胞（γδT细胞、CD3+细胞等）发生反应，从而深入探究相关机制，以便于研制出新的疫苗或者抗TB药物。M.tb的胞壁中的含有大量的脂类成分，它们就像一层厚厚的保护荚膜，既可以抵抗不利环境的侵害，也具有免疫调节作用，特别是在宿主固有免疫和适应性免疫应答的诱导中均扮演重要的角色，所以这提示M.tb的脂类成分可以成为重要的抗M.tb疫苗或者药物研究的靶点。本实验首先观察，在体外培养结核杆菌裂解物刺激人外周血单个核细胞（PBMC）的实验中，将胎牛血清（FBS）和人AB型血清作为培养液添加剂的效果比较。其次观察，我们挑选的一些脂类抗原对人外周血中PBMC活化和增殖的作用，进而探讨脂类抗原在结核感染中是否存在特异性免疫作用。
　　方法：（1）抽取健康成人外周血，分别加入结核杆菌全菌裂解物（WCL）或者同时给予人重组白细胞介素-2（rhIL—2）和植物血凝素（PHA），同时设置空白对照组，之后分别在含10％人AB型血清的RPMI1640培养液和10%FBS的RPMIl640培养液中培养6天后，用倒置显微镜观察培养结果，运用流式细胞仪（FCM）检测淋巴细胞增殖情况。（2）运用FCM和酶联免疫斑点实验（ELISPOT）分别检测，从PBMC中分里出来的粘附细胞被IL-4和GM-CSF诱导培养前后的表面抗原（CD11c，CD14，CD83）的表达，同时再检测已经被诱导培养成非成熟的树突状细胞（imDCs）且被下列抗原WCL，全脂质（TLIP），丙酮可溶性脂质（ASLIP），纯硫脂（PSLIP），脂阿拉伯糖（LAM），LM，培养液分泌蛋白（CFP），结核杆菌耐热抗原（M.tb-HAg），磷酸脂多糖（LPS）和空白对照组刺激培养后的细胞表面抗原（CD83）表达和IL-12分泌情况。（3）运用酶联免疫吸附测定法（ELISA）分别检测，非粘附的PBMC（预先被CFSE标记过）加入到抗原已经刺激过的imDCs后，共同培养3天后用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测各组培养上清液内TNF-α的浓度。当培养到第9天，运用FCM检测各组PBMC的T细胞亚群（CD3，CD4，CD8，NKT和γδT）增殖和分泌IL-4，TNF-α和IFN-γ的情况。
　　结果：（1）添加人AB型血清培养基培养条件下，M.tb WCL对淋巴细胞增殖效果较同样条件下添加FBS培养的增殖效果明显，差异有统计学意义（P<0.05）。（2）用IL-4和GM-CSF诱导培养后的粘附细胞表面CD11c，CD14的比例相较于培养前的比例明显下降，而表达CD1a的细胞比例则明显上升，差异有统计学意义（P<0.05）。（3）所有抗原在刺激imDCs后的成熟度标记CD83的比例相较于空白对照组均有明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。（4）除了ASLIP组外，其它抗原在刺激imDCs后，其分泌的IL-12的细胞数量相较于空白对照组均明显增多，差异有统计学意义（P<0.05）。（5）除了ASLIP和LM外，其它各抗原均能导致混合后的PBMC在培养3天后分泌TNF-α的浓度相较于空白对照组升高，而LM却能导致PBMC分泌TNF-α的浓度相较于空白对照组降低，差异有统计学意义（P<0.05）。（6）PBMC培养至9天后，各抗原均能促进CD8+T细胞和NKT细胞增殖，M.tb-HAg能促进γδT细胞增殖，相较于空白对照组差异有统计学意（P<0.05）。（7）除了CFP和LM外，其它抗原均能促进增殖的CD8+T细胞分泌TNF-α，而LM却能起到抑制作用，相较于空白对照组差异有统计学意（P<0.05）。此外，除了WCL，TLIP和LM外，其它抗原均能促进增殖的γδT细胞分泌TNF-α，相较于空白对照组差异有统计学意（P<0.05）。（8）所有抗原均能促进增殖的CD8+T和CD4+T细胞分泌IFN-γ，而其中的WCL，ASLIP，M.tb-HAg，LM和LPS还能促进增殖的γδT细胞分泌IFN-γ，相较于空白对照组差异有统计学意（P<0.05）。（9）除了TLIP，PSLIP外，其它抗原均能促进未增殖的CD4+T细胞分泌IL-4，相较于空白对照组差异有统计学意（P<0.05）。
　　结论：（1）当以M.tb WCL为抗原的刺激人PBMC时，淋巴细胞在添加人AB型血清培养液中比在添加FBS的培养液中增殖效果更加明显。（2）我们所选的各类脂类抗原均能激活PBMC的特异性免疫反应，具有潜在的抗TB药物和疫苗组分可能性。

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1前言

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1结核分枝杆菌抗原及其配制

2.1.2 实验标本来源

2.1.3 主要试剂

2.1.4 主要仪器和设备

2.1.5 主要试剂配制

2.2实验方法

2.2.1 人AB型血清的分离

2.2.2 人外周血（全血）PBMC分离

2.2.3 人外周血白细胞浓缩液中PBMC分离

2.2.4 PBMC的冻存与复苏

2.2.5 CFSE和PI染色

2.2.6 两种血清对结核杆菌抗原培养的比较

2.2.7单核细胞的分离和诱导培养

2.2.8粘附细胞的培养前后表面抗原检测以及ELISPOT检测IL-12的分泌

2.2.9 ELISA检测培养中的T淋巴细胞TNF-a含量

2.2.10培养后细胞增殖情况及其增殖亚群检测

2.2.11抗原刺激扩增培养后T细胞分泌IFN-γ，IL-4，TNF-α的检测

2.3 统计学分析

3结果

3.1两种血清对结核杆菌抗原刺激人外周血细胞增殖的比较

3.1.1 外周血淋巴细胞生长的动态观察

3.1.2外周血单核细胞增殖检测

3.2粘附细胞分离和诱导成功的流式细胞仪结果

3.2.1外周血粘附细胞的动态观察

3.2.2分离粘附细胞的流式细胞仪结果 CD14和CD1a表达培养前后变化

3.3 imDCs被多种抗原刺激后流式细胞仪检测成熟度

3.4多种抗原刺激imDCs后ELISPOT检测结果

3.5 PBMC培养中的ELISA检测结果

3.6抗原刺激扩增培养后T细胞亚群增殖情况

3.7抗原刺激扩增培养后T细胞分泌IFN-γ，IL-4，TNF-α的检测

3.7.1 TNF-α分泌情况

3.7.2 IFN-γ分泌情况

3.7.3 IL-4分泌情况

4讨论

5结论

参考文献

附录

综述: NKT细胞在结核杆菌脂类抗原作用的研究进展