体外研究人脐带血间充质干细胞诱导大鼠枯否细胞M2极化

摘要

目的：众所周知，目前晚期肝硬化患者除肝移植外无较好的治疗方法，但肝移植供体紧缺，配型复杂，等待周期长，移植费用高，极大的限制了肝移植的临床应用。随着干细胞替代治疗研究的兴起，目前干细胞移植有望成为终末期肝病的有效治疗方法。间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSCs)具有强大的分化能力能为许多终末期疾病带来希望，是一种多能干细胞。具有提取方法简单，低成本，低免疫性等特点。随着研究的深入，越来越多的证据表明MSCs通过免疫调节或者分泌细胞因子的机制来调节炎症反应和组织修复，从而发挥其主要的治疗作用。本实验采用内毒素(lipopolysaccharide，LPS)诱导大鼠枯否细胞(kupffer cells,KCs)发生极化改变，之后用人脐带血间充质干细胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells，huMSCs)与LPS诱导的KCs在transwell内共培养，观察huMSCs对KCs极化偏移的调节作用，进一步来研究MSCs对炎症免疫调节及其作用机制。
　　方法：采用胶原酶在体灌注和离体消化、密度梯度离心和选择性贴壁法，并结合机械分离和振荡孵育，最大程度的消化SD大鼠肝组织从而高效得到更多的原代KCs。经过形态观察，吞噬功能检测，细胞表面标志检测等方法验证细胞。成功取得KCs后，进行培养。同时进行huMSCs细胞培养，观察，验证。之后将KCs与MSCs在Transwell内共培养。实验分为KCs组(正常组)，KCs细胞+LPS组(对照组)，MSCs+KC+LPS组(实验组)。实验组用经典的LPS刺激原代大鼠KCs发生极化后再与huMSCs共培养18h，正常组加入等量DMEM培养基，对照组在LPS刺激后，加入DMEM培养基作为对照。观察同一时间点各组的IL-4，肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)，IL-10，IL-6等上清因子变化，以上上清因子用ELISA法进行检测；用Westing-blot方法检测诱导型一氧化氮合酶(inducible nitricoxide synthase，iNOS)，精氨酸酶-1(arginase-1,Arg-1)，信号传导与转录激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)STAT-3，STAT-6，核因子kappaB(nuclear factor-kB，NF-κB)。同时用qRT-PCR对以上结果进行验证。检测结果采用统计学软件分析，均数±标准差(X±S)表示，F检验判断两样本间的方差齐性，多组间差异检验采用单因素方差分析，t检验分析两组间统计学差异。
　　结果：对照组促炎因子TNF-α分泌增加，实验组抑炎因子IL-10，IL-4分泌增加，而IL-6的分泌实验组升高更明显；而Western-blot检测表明对照组中iNOS升高，NF-κBp65入核增高，而实验组高表达Arg-1，同时pSTAT-3，pSTAT-6表达增加，NF-κBp65入核减少，但是NF-κBpp65核内增多。经统计学检测结果提示huMSCs与枯否细胞极化后共培养后与对照组及空白组存在明显差异。
　　结论：分析以上数据结果表明huMSCs能诱导KCs向M2表型偏移，主要表现为抗炎因子分泌增加，Arg-1合成增加，考虑可能与huMSCs分泌细胞因子有关，起到一种免疫调节作用，huMSCs调节巨噬细胞极化的分子机制可能与通过JAK-STAT信号转导通路有关。该结论首次用不同种属细胞共培养研究巨噬细胞极化问题，且采用原代大鼠枯否细胞，更具有研究意义。同时该实验说明已经极化的枯否细胞是可以发生M2极化改变，但M2极化的巨噬细胞来源有待进一步验证。

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1.引言

2.材料和方法

2.1 材料和试剂

2.1.1 实验动物及细胞

2.1.2 主要试剂

2.1.3 部分实验用途试剂的配制

2.2主要仪器及来源

2.3实验方法

2.3.1枯否细胞的提取，纯化

2.3.2 枯否细胞的鉴定

2.3.3 huMSCs鉴定

2.3.4 huMSCs细胞的培养、传代

2.3.5 huMSCs与 KCs在 Transwll内共培养

2.3.6 各组枯否细胞的RNA提取

2.3.7 各实验组枯否细胞的RNA逆转录合成cDNA

2.3.8 荧光实时定量PCR Assay分析iNOS、Arg-1、IL-10、IL-6 mRNA转录水平

2.3.9蛋白印迹

2.3.10 ELISA

2.3.11数据处理和统计分析

3.结果

3.1 SD大鼠枯否细胞鉴定:

3.2实验各组培养上清液的ELISA法检测细胞因子

3.3 LPS诱导组高表达iNOS，而实验组高表达Arg-1。

3.4各组iNOS、Arg-1、IL-10、IL-6 mRNA水平检测

3.5 MSCs促进KCs向M2方向转化

3. 6 huMSCs调节巨噬细胞极化通过JAK-STAT信号通路实现

4.讨论

参考文献

附录

致谢

综述:从巨噬细胞极化看间充质干细胞对肝脏疾病免疫调节