血浆激肽释放酶激肽系统在三氯乙烯致敏小鼠肾脏损伤中的作用研究

摘要

背景：
　　三氯乙烯（Trichloroethylene，TCE）是一种具有挥发性的有机溶剂。由于其高效的去污能力，被广泛的用于工业中金属、线路板等物质的清洗。近年来，由于TCE大规模的生产和应用，已成为一种普遍存在的环境污染物，长期暴露的工人还可导致职业性TCE药疹样皮炎(ODMLT)。大量的临床病例显示，肾脏损伤最后导致的肾衰竭是许多患者死亡的原因之一，故肾脏损伤越来越受到研究者的重视。有研究发现血浆激肽释放酶-激肽系统(Plasma kallikrein-kinin system，KKS)与机体的炎症损伤和免疫系统有密切关系。本课题组前期研究发现 TCE致敏小鼠的肾脏中不仅有炎症性损伤，免疫性损伤也参与其中。故本研究探讨KKS在TCE致敏小鼠的免疫性肾损伤机制中的作用。
　　目的：
　　参考豚鼠最大值实验以及本课题组前期的研究报道建立TCE致敏的BALB/c小鼠模型。通过腹腔注射血浆激肽释放酶的特异性抑制剂PKSI以及检测KKS中的主要成分BK、PK、B1R、B2R以及 C5b-9的表达以探讨KKS在TCE致敏小鼠体内的活化情况以及其在免疫性肾损伤中的作用。
　　方法：
　　选购6～8W，体重20-25g的健康雌性BALB/c小鼠。经过一周的适应性饲养后，小鼠被随机分成4组，分别是：空白对照组、溶剂对照组、TCE处理组以及PKSI处理组。参考豚鼠最大值实验以及本课题组前期的研究报道建立BALB/c小鼠致敏模型，并在两次激发前24h腹腔注射PKSI。根据小鼠背部受试部位的致敏情况以及处死的时间不同将其分为TCE致敏24h、48h、72h和7d组、TCE未致敏24h、48h、72h和7d组、PKSI致敏24h、48h、72h和7d组和PKSI未致敏24h、48h、72h和7d组。采用ELISA法检测血浆中BK的表达水平。免疫荧光法检测肾脏组织中的BK、PK、B1R和B2R的沉积情况。qRT-PCR法检测肾脏组织中B1R和B2R mRNA表达水平。Western blot法检测肾脏组织中B1R和B2R蛋白表达水平。免疫组化法检测C5b-9在肾脏组织中的沉积情况。
　　结果：
　　1.致敏率
　　本研究中的空白对照组和溶剂对照组均未见到红肿现象；TCE处理组共有120只小鼠，其中有48只小鼠背部皮肤有明显的红肿，故致敏率为40％，致敏强度为中度；PKSI处理组也有120只小鼠，其中仅27只小鼠背部皮肤有明显的红肿，故致敏率为22.5%，致敏强度为轻度；本研究中，总的致敏率为31.25%。
　　2.肾脏病理检查结果
　　通过肾脏组织的 HE染色结果，发现TCE致敏组的肾脏中有大量的炎细胞浸润以及肾小管上皮细胞空泡样变性，而相应时点的PKSI致敏组的肾脏，损伤明显减轻。其余组未见明显异常。
　　3.肾功能检测结果
　　肾功能检查主要对血清中BUN和Cr这两个具有代表性的指标进行检测。结果发现，空白对照组与溶剂对照组的BUN和Cr相比，差异均无统计学意义（P>0.05）；与溶剂对照组相比，TCE致敏组的24h、48h和72h组的BUN和Cr表达明显增高且差异有统计学意义（P<0.05）；其中，TCE致敏组的48h和72h组的BUN表达明显高于相应时点的TCE未致敏组以及 PKSI致敏组（P<0.05）。TCE致敏组的24h、48h和72h组Cr的表达明显高于相应时点的未致敏组，且其72h组的表达与相应时点的PKSI致敏组相比，表达明显增高，差异有统计学意义（P<0.05）。
　　4.血浆中BK的表达水平
　　结果显示：空白对照组与溶剂对照组相比较，差异无统计学意义（P>0.05）。与溶剂对照组相比，TCE致敏组的四个时点以及PKSI致敏组的24h和48h组的BK表达水平明显增加，且差异有统计学意义（P<0.05）。TCE致敏组的24h、48h和72h组与相应的未致敏组相比，BK表达水平同样显著增加，且差异有统计学意义（P<0.05）。PKSI致敏组的72h组与相应时点的TCE致敏组相比，BK表达水平明显下降，且差异有统计学意义（P<0.05）。
　　5.肾脏组织中BK、PK、B1R和B2R的沉积情况
　　结果显示如下：肾脏组织中BK、PK、B1R和B2R沉积的变化趋势大致相似：在空白对照组与溶剂对照组中的沉积都比较少，甚至没有；而在TCE致敏组中四个指标的沉积量随着时点的变化逐渐增加，并在72h时点达到最高峰，在7d时有所恢复；PKSI致敏组的四个时点的四个指标都较TCE致敏组的相应时点的沉积量相对降低。
　　6.肾脏组织中B1R和B2R mRNA表达情况
　　采用qRT-PCR法检测肾脏组织中B1R和B2R mRNA的表达水平。结果如下：空白对照组与溶剂对照组相比，两个指标的差异均无统计学意义（P>0.05）。TCE致敏组的四个时点以及PKSI致敏组的24h和48h组的B1R mRNA表达水平与溶剂对照组相比较明显增加，且差异有统计学意义（P<0.05）。TCE致敏组的B2R mRNA表达水平也是逐渐增加的，且在72h时点达到最高。PKSI致敏组的B1R以及B2R mRNA表达水平都较TCE致敏组的相应时点相对降低。在72h时点组，TCE致敏组比PKSI致敏组的B1R和B2R mRNA表达水平显著增加，且差异有统计学意义（P<0.05）。
　　7.肾脏组织中B1R和B2R的蛋白表达水平
　　采用Western blot法检测肾脏组织中B1R以及B2R的蛋白表达水平。结果显示：空白对照组与溶剂对照组的B1R蛋白几乎不表达，B2R的表达也比较少。TCE致敏组的B1R和B2R的表达明显比溶剂对照组增加，且差异有统计学意义（P<0.05）。两个受体在TCE致敏组中的表达也明显比PKSI致敏组多，差异有统计学意义（P<0.05）。
　　8.肾脏组织中C5b-9的沉积情况
　　结果显示如下：在空白对照组与溶剂对照组中C5b-9的表达都比较少，且差异无统计学意义（P>0.05）；在TCE致敏组中24h、48h、72h沉积量逐渐增加，并在72h组达到最高峰，与溶剂对照组相比显著升高，差异有统计学意义（P<0.05），在7d时有所降低； PKSI致敏组的四个时点的C5b-9表达含量都较TCE致敏组的相应时点的表达明显降低，且在48h和72h时点两组差异有统计学意义（P<0.05）。
　　结论：
　　1.一定剂量的TCE可引起小鼠皮肤致敏反应并可导致小鼠的免疫性肾损伤。
　　2.TCE致敏小鼠体内补体激活的过程中还伴有KKS的活化，且 KKS的活化及其产物在TCE所致的免疫性肾损伤过程中可能起重要作用。

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英文缩略词

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英文摘要

1. 前言

2、材料和方法

2.1 材料

2.2 方法

2.3 统计学处理

3、结果

3.1 小鼠背部皮肤的致敏情况

3.2小鼠肾脏病理学检查结果

3.3肾功能检测结果

3.4 小鼠血浆中BK的表达水平检测

3.5免疫荧光法检测各组小鼠肾脏组织中BK、PK、B1R和B2R的沉积情况

3.6 实时定量PCR法检测B1R和B2R mRNA表达情况

3.7 小鼠肾脏组织中B1R和B2R的蛋白表达水平

3.8免疫组化法检测各组小鼠肾脏组织中C5b-9的沉积情况

4、讨论

5、结论

参考文献

个人简历

致谢

综述： 血浆激肽释放酶-激肽系统的研究进展