沉默酸敏感离子通道1a对胞外酸化诱导大鼠关节软骨细胞自噬的影响及其可能机制

摘要

酸敏感离子通道(acid-sensing ion channels，ASICs)是一类广泛存在于细胞膜上的阳离子通道，H+是最早发现的ASICs通道激动剂，开放的通道对Na+、Ca2+具有可通透性，参与细胞病理生理功能的改变。自噬(Autophagy)是一种依赖于溶酶体的细胞自我降解过程，具有多种生理病理功能。本课题组前期研究发现大鼠关节软骨细胞存在ASICs表达，胞外酸化刺激软骨细胞，细胞自噬水平升高，细胞凋亡增加，但具体机制尚不明确。本研究选用大鼠关节软骨细胞为研究对象，胞外酸化刺激软骨细胞为体外模型，采用小分子干扰RNA(siRNA)技术沉默ASIC1a基因表达，探讨ASIC1a对胞外酸化诱导的大鼠关节软骨细胞自噬的影响及其可能机制。
　　目的：本研究旨在观察 ASIC1a对胞外酸化诱导大鼠关节软骨细胞自噬活化的影响，并探讨其可能的分子机制。
　　内容：
　　1.观察不同的胞外酸化刺激条件下，大鼠关节软骨细胞自噬水平变化；
　　2.利用小分子干扰RNA(siRNA)技术建立体外ASIC1a的表达沉默模型并验证其沉默效率；
　　3.观察沉默或阻滞ASIC1a后，关节软骨细胞自噬水平的变化；
　　4.探讨ASIC1a参与胞外酸化诱导关节软骨细胞自噬活化的机制；
　　方法：
　　1.不同胞外酸化条件(pH7.4、7.0、6.5、6.0、5.5、5.0)/(pH6.0刺激15min、30min、1h、2h、3h、4h、5h)，作用于大鼠关节软骨细胞，通过 Western-blot法检测自噬蛋白LC3Ⅱ表达。
　　2.通过合成特异性荧光短链ASIC1a siRNA-FAM建立体外ASIC1a表达沉默模型，采用荧光倒置显微镜、Western-Blot及实时荧光定量PCR(q-RT-PCR)法检测ASIC1a沉默效率和对ASIC1a mRNA和蛋白表达的影响；
　　3.选择大鼠关节软骨细胞为实验对象，设正常组、pH6.0酸化模型组、PcTx1组（100ng/mL）、特异性ASIC1a siRNA沉默组、ASIC1a siRNA沉默阴性对照组，激光共聚焦技术检测胞内[Ca2+]i水平；吖啶橙染色(Arcidine Orange，AO)观察软骨细胞酸性小体形成情况；实时荧光定量PCR及Western-Blot法检测关节软骨细胞自噬相关基因LC3Ⅱ、Beclin1和ULK1含量；
　　4.选择大鼠关节软骨细胞为实验对象，设正常组、pH6.0酸化模型组、BAPTA-AM组、特异性ASIC1a siRNA沉默组、ASIC1a siRNA沉默阴性对照组、BAPTA-AM+特异性ASIC1a siRNA沉默组，GFP-LC3质粒转染观察细胞内LC3水平；实时荧光定量PCR及Western-Blot法检测关节软骨细胞自噬相关基因?LC3Ⅱ、Beclin1和ULK1含量；
　　5.关节软骨细胞胞外酸化刺激，采用Western-blot法检测各组细胞 CaMKKβ、AMPK、mTOR的磷酸化水平；
　　6.胞外酸化刺激大鼠关节软骨细胞，设正常组、pH6.0酸化模型组、3-MA自噬抑制剂组、特异性ASIC1a siRNA沉默组、ASIC1a siRNA沉默阴性对照组、3-MA+特异性ASIC1a siRNA沉默组，Hoechst33342染色分析细胞凋亡情况；流式细胞术观察细胞凋亡；实时荧光定量PCR法检测关节软骨细胞凋亡相关基因?Bax和Bcl-2的含量。
　　结果：
　　1.胞外酸化刺激大鼠关节软骨细胞，自噬标志性蛋白 LC3Ⅱ呈时间和pH依赖性增加，且在pH6.0，3h时表达量达到最大水平；
　　2.化学合成的特异性ASIC1a siRNA可成功转染入大鼠关节软骨细胞，转染后，软骨细胞ASIC1a mRNA和蛋白水平显著下调；
　　3.采用ASIC1a阻滞剂PcTX1和ASIC1a siRNA可导致关节软骨细胞胞内Ca2+浓度降低，并且可以抑制胞外酸化诱导软骨细胞自噬活化，表现为：LC3Ⅱ、Beclin1和ULK1表达量显著下调，AO染色结果表明细胞内酸性自噬溶酶体数目减少；4．ASIC1a siRNA和BAPTA-AM组中胞外酸化诱导的大鼠关节软骨细胞自噬活化减少，表现为：LC3Ⅱ、Beclin1和ULK1的水平显著下调，细胞内GFP-LC3数目减少。
　　5.沉默ASIC1a组或BAPTA-AM组可抑制胞外酸化诱导的CaMKKβ及AMPK磷酸化水平升高和mTOR磷酸化水平降低。
　　6.沉默ASIC1a或3-MA自噬抑制组，Bax mRNA表达量下降，Bcl-2 mRNA表达量升高，软骨细胞凋亡程度显著下降。
　　结论：
　　1. ASIC1a参与胞外酸化诱导大鼠关节软骨细胞自噬活化过程；
　　2. ASIC1a siRNA转染可成功构建体外关节软骨细胞ASIC1a表达沉默模型；
　　3.沉默或抑制ASIC1a抑制酸化导Ca2+超载，抑制酸化诱导的自噬活化；
　　4. ASIC1a通过调节CaMKKβ、AMPK、mTOR信号通路发挥抑制胞外酸化诱导的大鼠关节软骨细胞自噬活化作用。

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1 前言

2 实验材料

2.1 动物

2.2 药物和试剂药物和试剂名称

2.3 主要溶液配制

2.4 仪器和设备

3 实验方法

3.1 大鼠关节软骨细胞分离、培养与鉴定

3.2 胞外酸化对大鼠关节软骨细胞自噬的影响

3.3 ASIC1a沉默模型的鉴定

3.4 激光共聚焦检测大鼠关节软骨细胞的Ca2+内流变化

3.5 胞外酸化刺激对大鼠软骨细胞自噬的影响

3.6 钙离子螯合剂BAPTA-AM对胞外酸化诱导自噬的影响

3.7 Western Blot法检测软骨细胞CaMKKβ、AMPK、mTOR的表达

3.8 抑制自噬观察软骨细胞凋亡率

3.9 统计处理

4 结果

4.1大鼠关节软骨细胞的分离与鉴定

4.2 Western-blot检测胞外酸化刺激后大鼠关节软骨细胞自噬蛋白LC3的表达

4.3 胞外酸化ASIC1a沉默模型的鉴定

4.4 沉默ASIC1a对胞内钙离子水平的影响

4.5 siRNA ASIC1a对胞外酸化诱导大鼠关节软骨细胞自噬作用的影响

4.6 钙离子螯合剂BAPTA-AM对胞外酸化诱导软骨细胞自噬的影响

4.7 沉默ASIC1a对酸化诱导大鼠关节软骨细胞CaMKKβ、AMPK和mTOR表达的影响

4.8 抑制自噬观察软骨细胞凋亡的影响

5 讨论

6 小结

参考文献

附录

致谢

综述: 自噬和凋亡交互作用的分子机制