呼吸道合胞病毒合并肺炎克雷伯菌感染所致肺炎与TLR4-NF-κB信号通路关系的初步研究

摘要

目的：
　　本研究拟用呼吸道合胞病毒合并肺炎克雷伯菌感染诱发SD大鼠引起肺炎，观察SD大鼠肺组织病理变化，检测TLR4通路相关因子的表达情况，初步探讨其与TLR4-NF-κB信号转导通路的关系。
　　方法：
　　60只雄性SD大鼠随机分为四组：对照组、RSV组、Kp组及 RSV+Kp组，每组各15只。通过滴鼻感染法处理各组SD大鼠，于第0、1、3、5、7 d相同时间段测量其体重、肺指数（LI），H&E染色观察肺部病理变化，RT-PCR检测TLR4及NF-κB的mRNA表达情况，Western blot检测NF-κB蛋白质的表达丰度，ELISA检测肺泡灌洗液中TNF-α和IL-1β炎性因子的分泌量。
　　结果：
　　（1）肺指数：与正常对照组相比，RSV组、Kp组和RSV+Kp组SD大鼠LI呈逐渐递增趋势，RSV组和Kp组在感染后第3、5天升高，差异有统计学意义（P<0.05），第7天显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）；与RSV组和Kp组相比，RSV+Kp组SD大鼠LI在感染后随时间延长逐渐升高，第5、7天差异有统计学意义（F=7.027，P<0.05）。
　　（2）肺组织病理：正常对照组SD大鼠肺泡结构清楚，壁薄无充血，肺间质无炎症细胞浸润。RSV组和Kp组在感染后第3天开始出现弥漫性肺泡间隔增厚与肺泡壁破坏，且均随感染时间的延长，肺泡结构破坏逐渐加重。而 RSV+Kp组从第1天开始肺组织就有炎性细胞浸润，并且在感染后同一时期较RSV组和Kp组更为严重。
　　（3）mRNA转录水平：正常对照组SD大鼠肺组织中TLR4 mRNA、NF-κB mRNA表达很低；随着感染时间的延长，RSV组、Kp组和RSV+Kp组TLR4 mRNA、NF-κB mRNA表达量逐渐增加，有时间依赖性。RSV组TLR4 mRNA表达在感染后第5、7 d升高，差异统计学意义（P<0.01），NF-κB mRNA在感染后第5 d升高，差异有统计学意义（P<0.05），第7 d显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）；Kp组TLR4 mRNA表达在感染后第3 d升高，差异有统计学意义（P<0.05），第5、7 d显著升高，差异有统计学意义（P<0.01），NF-κB mRNA在感染后第3d升高，差异有统计学意义（P<0.05），第5、7 d显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）。RSV+Kp组较RSV组TLR4 mRNA、NF-κB mRNA表达在感染后第5、7 d升高，差异有统计学意义（P<0.05）；较Kp组TLR4 mRNA表达在感染后第7 d升高，差异有统计学意义（P<0.05），NF-κB mRNA表达在感染后第5、7 d均升高，差异有统计学意义（F=6.373,P<0.05）。
　　（4）NF-κB蛋白表达：正常对照组中SD大鼠肺组织中NF-κB蛋白水平表达量较低，而在RSV组、Kp组和RSV+Kp组NF-κB蛋白随着感染时间的延长表达不断增加。RSV组在感染后第5天明显升高，差异有统计学意义（P<0.05），第7天显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）；Kp组NF-κB蛋白表达Kp组NF-κB蛋白表达在感染后第3天明显升高，差异有统计学意义（P<0.05），在感染后第5、7天显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）；与RSV组相比，RSV+Kp组NF-κB蛋白在感染后第3、5、7天升高有统计学意义（P<0.05），与Kp组相比，RSV+Kp组NF-κB蛋白在感染后第5、7天升高差异有统计学意义（P<0.05）。
　　（5）TNF-α、IL-1β含量：正常对照组中TNF-α和IL-1β含量较低，而在RSV组、Kp组和RSV+Kp组TNF-α、IL-1β含量随着感染时间点的延长逐渐增加，有时间依赖性。RSV组和Kp组 TNF-α在感染后第5、7天明显升高，差异有统计学意义（F=9.137,P<0.05）；与RSV组和Kp组相比，RSV+Kp组TNF-α含量较RSV组在感染后第5天升高，差异有统计学意义（P<0.05），第7天显著升高，差异有统计学意义（P<0.01），较Kp组第5、7天明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。RSV组和Kp组 IL-1β含量在感染后第5、7 d均显著升高，差异有统计学意义（F=8.737,P<0.01）；与RSV组和Kp组相比，RSV+Kp组IL-1β含量在感染后第5、7天均显著升高，差异有统计学意义（F=8.871,P<0.01）。
　　结论：
　　（1）通过滴鼻法建立RSV合并Kp感染诱发SD大鼠引起肺炎的动物模型可行。
　　（2）RSV和Kp混合感染具有协同作用，加重肺部炎症。
　　（3）RSV合并Kp感染可能通过TLR4-NF-κB途径诱导肺部防御细胞释放细胞因子TNF-α和IL-1β等。

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1. 前言

2.材料与方法

2.1 材料

2.1.1 细菌及病毒准备

2.1.2 实验动物

2.1.3 试剂

2.1.4 仪器和设备

2.2 方法

2.2.1 溶液的配制

2.2.2 RSV增殖及感染单位量测定：

2.2.3 动物模型建立和实验分组

2.2.4 动物肺指数的测定

2.2.5 肺组织病理切片

2.2.6 TLR4、NF-κB在不同组的mRNA转录水平检测：

2.2.7 SD大鼠肺组织NF-κB蛋白的Western blot检测

2.3 统计学分析

3 结果

3.1 LI变化情况

3.2 肺组织病理学形态改变

3.3 RT-PCR检测肺组织TLR4、NF-κB mRNA表达

3.3.1 RT-PCR检测肺组织TLR4 mRNA表达

3.3.2 RT-PCR检测肺组织NF-κB mRNA表达

3.4 Western blot 检测SD大鼠肺组织NF-κB蛋白表达

3.5 ELISA检测SD大鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β含量

4 讨论

5 结论

参考文献

附录

致谢

综述:肺炎克雷伯菌肺炎的分子机制研究进展