新型优化多肽pm11对口腔常见微生物杀菌作用的初步研究

摘要

1.背景与目的：
　　龋病是最常见的口腔疾病之一。在美国有近90％的青少年或年轻成人患有，或者曾患有龋病。食物、病原菌、宿主和时间为龋病发生的主要因素。多种细菌、蛋白等在牙齿表面作用一定时间形成生物膜。生物膜结构能够保护内部细菌免受外界刺激的伤害,还能够增强细菌对一般抗菌药物的抵抗能力。因此，对生物膜的控制一直是龋病防治的关键。氟化物的防龋能力是肯定的，但其推广有一定的限制。传统抗生素容易诱使细菌发生突变而产生耐药性。因此，需要研发新型的能够抑制游离或生物膜状态微生物的药物。
　　抗菌肽是近来口腔微生物学研究的热点，抗菌肽因为具有抗菌谱广、无免疫原性等特点，所以极有可能成为一种高效、低毒的临床新型药物。从美洲鲽(Pleuronectes americanus)的表皮中分离出来的α螺旋阳离子抗菌肽pleurocidin，成为近年来研究较多的抗菌肽之一，具有确定的抗菌效果。但是 pleurocidin的长度为25个氨基酸，过长的氨基酸更加难以渗透进入生物膜内部，而且过长氨基酸应用于临床上也提高了合成成本，因此我们需要开发新的短肽。本研究在pleurocidin活性中心的基础上设计的新型抗菌多肽pm11，并验证其杀菌效果。
　　2.方法：
　　2.1使用二倍稀释法检测pm11对口腔常见微生物的MIC（最小抑菌浓度），然后使用平板涂布法检测MBC（最小杀菌浓度）。
　　2.2使用检测时间杀死曲线（CLSI M26-A）的方法测定高浓度pm11对口腔常见微生物的抗菌作用。
　　2.3通过软琼脂铺板抑菌圈方法进一步直观检测pm11对口腔常见微生物在唾液环境下的抗菌作用。
　　2.4培养细菌生物膜，以PBS处理组为阴性对照，异丙醇处理组为阳性对照，pm11处理组为实验组，使用活菌死菌染色剂（LIVE/DEAD? BacLightTM Bacterial Viability Kit L-13152, Invitrogen Inc.美国）避光染色后，激光共聚焦(CLSM)观察生物膜。
　　2.5培养细菌悬液，以PBS处理组为阴性对照，pm11处理组为实验组。固定脱水冷冻干燥喷金后使用扫描电子显微镜（SEM）观察pm11的杀菌作用。
　　3.结果：
　　3.1 pm11对8种微生物具有抗菌活性，且抗菌活性相差很大,MIC范围为2-256μg/ml，MBC范围为4->256μg/ml。
　　3.2短期（2h）杀菌动力学结果显示致龋菌随着pm11作用时间的增加，存活细菌数显著下降。
　　3.3溶解在唾液和超纯水中的pm11的抑菌效果并没有统计学差异（P>0.05），而且浓度越大，pm11的杀菌效果越强。
　　3.4 pm11处理组红色死菌数量明显增多，而且死菌的区域有向团聚生物膜内细菌蔓延的趋势。
　　3.5 SEM结果直观地看到pm11作用下的细菌细胞膜表面有明显的孔洞、细胞皱缩、细菌溶胀及细胞裂解或碎片。
　　4.结论：
　　4.1 pm11对悬浮态细菌具有不同的杀菌作用并且呈时间和浓度依赖性。
　　4.2 pm11对细菌生物膜具有一定的抗菌活性。
　　4.3 pm11可能主要通过破坏细菌细胞膜，引起细菌内容物流出，从而导致细菌死亡。

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主要英文缩写词表

中文摘要

英文摘要

前言

实验一 pm11对口腔常见致龋菌的MIC、MBC测定

1.实验材料

2.实验方法

3.实验结果

4.讨论

实验二 pm11对口腔常见致龋菌的杀菌动力学曲线测定

1. 实验材料

2. 实验方法

3.实验结果

4.讨论

实验三 唾液等口腔环境对pm11抗菌作用的影响

1. 实验材料

2. 实验方法

3.实验结果

4.讨论

实验四 pm11对变异链球菌生物膜的杀菌作用研究

1. 实验材料

2. 实验方法

3. 实验结果

4.讨论

实验五 pm11对口腔常见致龋菌杀菌机制的扫描电镜观察

1.实验材料

2. 实验方法

3.实验结果

4.讨论

结论

参考文献

附录:本人简历

致谢

综述:抗菌肽抑制口腔病原微生物的研究进展