缓释核壳结构利用基因传递修复骨缺损的实验研究

摘要

背景及目的：
　　基因治疗是近年来一种崭新的疾病治疗方式，而目前的基因治疗载体只能实现瞬时转染，细胞因子活性与表达时效不高，成骨量少，制约骨组织工程研究的发展。新型转染试剂壳聚糖的衍生物，有着很多的优势比如较高的转染效率，较好的生物相容性和生物可降解性，以及缓慢得释放细胞因子。骨形态发生蛋白4（BMP4）能够诱导动物或人体间充质细胞分化为骨、软骨、韧带、肌腱和神经组织，在骨形成的数个阶段均起关键作用，现已成为研究成骨诱导的热点。本实验的研究用骨形态发生蛋白4(BMP4)-绿色荧光蛋白(EGFP)融合基因与巯基烷基化壳聚糖(TACS)相互作用形成核结构(TACS-pBMP4-EGFP)，再与羟丁基壳聚糖(HBC)相互作用形成核壳结构(TACS/HBC-pBMP4-EGFP)，观察核壳结构对骨缺损的修复作用。
　　方法：
　　利用骨形态发生蛋白4(BMP4)-绿色荧光蛋白(EGFP)融合基因的负电性与TACS的正电性相互作用形成核结构(TACS-pBMP4-EGFP)，再与HBC相互作用形成核壳结构(TACS/HBC-pBMP4-EGFP)。利用动态光散射，透射电镜，凝胶电泳，验证TACS、HBC对pBMP4-EGFP的包裹。对HEK293T细胞进行体外转染，荧光显微镜、流式细胞仪以及Western blot实验探索核及核壳结构的转染效率。构建兔双侧桡骨18mm长的完全性骨缺损模型，植入携载核壳结构的异体脱细胞骨支架材料，于术后0，4，8周分别通过大体观察、X线、苏木精-伊红染色观察骨缺损的修复情况。
　　结果：
　　利用动态光散射仪器、透射电镜对核及核壳结构进行表征，可见随着氮磷比增加,TACS-pBMP4-EGFP直径逐渐减小。当氮磷比大于8时， TACS-pBMP4-EGFP直径小于200 nm，包裹HBC后，TACS/HBC-pBMP4-EGFP粒径小幅度增加且电势趋于中性，易于被细胞内吞，转染表达出BMP4。凝胶电泳试验可见合适氮磷比时，核及核壳结构可以很好地携载和保护质粒。流式细胞仪和Western blot结果均显示随着转染时间增加，核壳结构转染率逐渐增高。兔桡骨缺损修复过程中，X线片可见携载核壳结构的缺损处骨密度明显增高，皮质骨连续性较好，呈骨性愈合。
　　结论：
　　TACS/HBC-pBMP4-EGFP具有良好的缓释功能，可以较长时间得持续转染成骨基因，促进骨缺损的愈合。

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1.引言

2.实验材料

2.1 细胞

2.2 动物

2.3 试剂及来源

2.4 主要溶剂的配制

2.5 主要仪器和设备

3.实验方法

3.1 HEK 293T细胞的培养

3.2 pBMP4-EGFP的扩增与提取

3.3核壳结构（TACS/HBC-pBMP4-EGFP）的制备及表征

3.4 MTT毒性检测

3.5 体外转染实验

3.6 蛋白免疫印迹实验（Western Blot）

3.7 动物模型的制备及成骨检测

4.结果

4.1 核及核壳结构的形态结构表征

4.2 动态光散射

4.3 凝胶电泳实验

4.4 细胞毒性试验

4.5 体外转染免疫荧光检测

4.6 流式细胞仪检测

4.7 Western blot

4.8 兔桡骨缺损修复

5.讨论

6.结论

7.问题与展望

参考文献

附录

致谢

综述: 壳聚糖用于骨缺损治疗的研究进展