经血源性子宫内膜干细胞的生物学特性及多向分化潜能的实验研究

摘要

目的:现阶段，用于研究干细胞的主要材料来源于胚胎干细胞和骨髓间充质干细胞，但这两种来源的干细胞都存在着部分的局限性，例如涉及创伤性、伦理道德性等，所以现临床急需要寻找一种新型的干细胞以避免上述干细胞标本伦理学的争议、来源的缺乏及肿瘤形成的潜在性等弊端。本实验主要研究来源于经血的经血源性子宫内膜干细胞(menstrual blood-derived mesenchymal stem cells。MenSCs)在体外获取及培养增殖的方法并鉴定，观察细胞的形态及生长情况等基本生物学特性以及体外诱导其向成骨细胞成脂细胞方向分化以及重点实验体外诱导其向子宫内膜上皮和间质细胞方向分化的可行性及不同浓度雌激素对分化结果的影响。为其在临床中的应用奠定一定基础。
　　方法:本实验采用Ficoll密度梯度法从月经第二天健康女性经血中分离MenSCs,采用经典的MTT法对体外扩增的第一代、第二代细胞描绘生长曲线，并通过传代培养、体外扩增,使用倒置光学显微镜下观察细胞形态及在培养过程中的动态增殖变化。第二代细胞经流式细胞仪检测免疫表型的表达情况。取第二代 MenSCs,分成诱导组和对照组。分别按5×104/mL接种至明胶包被的6孔板中,24小时细胞贴壁后。诱导组培养液更换成干细胞成骨诱导分化基础培养基+专用血清,成骨诱导液为：双抗、200μmol/L抗坏血酸、10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠和0.1μmol/L地塞米松。对照组培养液换为L-DMEM添加10％FBS,细胞置入37℃、5%CO2细胞培养箱中进行培养,每两天换液1次,连续培养3周。分别在第1、2、3周结束诱导结束时，通过检测ALP活性、胶原表达情况、以及钙结节表达情况，观察成骨诱导的效果；分组方法同上，取第2代MenSCs,按5×104/mL接种于被明胶包被的6孔板中,细胞过夜贴壁后诱导组更换为干细胞成脂诱导分化基础培养基+专用血清,1×10-6mol/L地塞米松,10mol/L胰岛素,0.5mmol/L IBMX,0.2mmol/L吲哚美辛,对照组培养液L-DMEM添加10% FBS,细胞置入37℃、5% CO2细胞培养箱中进行培养,每两天换液1次。分别在诱导2、3、4周结束时,进行油红O染色，镜下观察油红染色的结果。通过检测MenSCs成骨成脂的诱导情况。探讨其在体外向成骨成脂方向分化的潜能。将培养后的MenSCs分为4个研究组，每组培养体系中添加生长因子(TGF-β10ng/ml。EGF10ng/ml。PDGF-BB10ng/ml)和不同浓度17-β-雌二醇(1×10-9 mol/L、1×10-8 mol/L、1×10-7 mol/L、1×10-6mol/L),分别标记为组1、组2、组3、组4，培养体系中未添加生长因子和雌激素的组为对照组。诱导培养5天后观察细胞形态学变化及应用免疫细胞化学法检测人子宫内膜上皮细胞标记物角蛋白（cytokeratin，CK）和基质细胞标记物波形蛋白（Vimentin，VIM），同时运用RT-PCR和Westernblot检测CK、VIM mRNA表达水平及蛋白表达的量，以进一步验证MenSCs是否向子宫内膜方向分化及不同雌激素浓度对分化过程的影响。
　　结果:本实验表明利用 Ficoll离心法能从健康女性月经血中分离并培养出干细胞，此原代细胞约1.5周达到85%~90%融合，细胞多成梭形、漩涡状、辐射状。MTT法得出细胞倍增时间约为30~32h。此细胞传代后能稳定生长，可见细胞形态以纤维样为主导。发现传代中，在接种细胞1~2天，细胞增殖缓慢，第3~4天全量换液后细胞生长迅速，进入对数生长期，接着5-6天后细胞生长较前缓慢，进入平台期，整个过程未出现抑制现象。用流式细胞仪术检测结果显示，此类细胞表面标记OCT-4、Strol-1、CD45、表达率分别为95.13%±0.81%，1.80%±0.92%，0.93%±0.42%。细胞表现出OCT-4强阳性，Strol-1、CD45阴性。此说明培养的细胞具有胚胎干细胞性质。诱导分化实验表明MenSCs成骨诱导前期诱导组细胞胶原表达量较后期升高,MenSCs诱导两周后经茜素红染色可见钙结节明显,诱导组细胞ALP(alkaline phosphatase)活性-成骨细胞分化成熟的重要标志随着诱导时间延长呈上升趋势，强阳性，对照组阴性。经成脂诱导3周,有明显的脂滴出现，油红O染色呈阳性，对照组阴性。体外向子宫内膜细胞方向分化结果表明：各研究组 CK、VIM mRNA表达水平及蛋白表达量明显高于对照组（p<0.05)；组2（1×10-8mol/L）CK mRNA表达水平最高与其他4组相比较(p<0.05，)，且CK mRNA表达量随雌激素浓度增高略有下降；而VIM的mRNA表达量相反，即随着雌激素浓度增高 VIM mRNA表达的量增加，但差异无统计学意义。CK和 VIM蛋白相对表达量也显示这一结果。证实MenSCs在体外细胞生长因子和雌激素刺激下能够向子宫内膜细胞方向分化，且雌激素浓度不同分化结果有差异。
　　结论:通过Ficoll密度梯度离心法能获得MenSCs，流式细胞术检测特定的细胞表面标志物也证实了其为经血源性子宫内膜干细胞，进一步的实验也表明其能在体外诱导向成骨细胞和脂肪细胞方向分化。MenSCs在体外能够诱导向子宫内膜上皮和间质细胞方向分化。生长因子和雌激素在此过程中起重要作用，并且不同浓度雌激素分化的效果影响不同。其具有较高的增殖能力、较低免疫原性、来源广泛、多向分化潜能等特性,为经血源性子宫内膜间充质干细胞用于临床应用提供一定的理论依据，有望成为组织工程较为理想的种子细胞。

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1 引言

2 材料和方法

2.1材料与方法

2.2实验器材及设备

2.3标本来源及试剂配制

2.4实验方法

2.5 统计学分析

3 结果

3.1 MenSCs的原代培养结果

3.2流式细胞鉴定结果

3.3细胞生长动力学

3.4细胞成骨诱导

3.5细胞成骨诱导

3.6细胞成骨诱导

3.7细胞成脂分化

3.8体外向子宫内膜细胞方向分化诱导

4 讨论

5 结论

参考文献

7 附录

致谢

综述:子宫内膜干细胞的研究进展