芦丁抑制H2O2诱导的人晶状体上皮细胞氧化损伤和凋亡及其机制研究

摘要

目的：
　　白内障是老龄化人口中引起视力下降和致盲的首要原因，已经成为一个不容忽视的全球性的公共健康问题之一。晶状体上皮细胞的凋亡是人类和动物非先天性白内障发生和发展的共同的细胞学基础。氧自由基又是晶状体上皮细胞凋亡的主要原因。因此，抑制晶状体上皮细胞的氧化损伤和凋亡对预防白内障的发生、发展具有重要意义。研究表明芦丁具有显著的清除各种自由基的特性。基于以上观点，在本研究中我们将建立人晶状体上皮细胞氧化损伤模型，通过检测不同的氧化损伤、凋亡等指标系统地观察天然抗氧化剂芦丁对H2O2诱导的晶状体上皮细胞的氧化损伤和凋亡的影响，并且进一步探讨其中可能的机制。为临床上药物治疗早期白内障的发生、发展提供新的研究方向。
　　方法：
　　1．取对数生长周期的 SRA01/04人晶状体上皮细胞，分别加入0,50,100,200,400,800μM H2O2及0,25,50,100,200,400μM芦丁，处理24h后采用MTT法分别测量每组的细胞生存率，据此设计实验所需的芦丁和H2O2浓度。
　　2．将细胞分为5组，对照组，H2O2组，25μM芦丁组，50μM芦丁组，100μM芦丁组。MMT法检测各组细胞的生存率，显微镜下观察各组细胞的形态学变化，细胞划痕法检测各组细胞的迁移率。评价不同浓度芦丁对细胞形态以及对细胞增殖能力的影响。
　　3．使用DCFH-DA法测量上述各组细胞内活性氧（ROS）的含量；使用黄嘌呤氧化法检测各组细胞的超氧化物歧化酶（SOD）活性；酶联免疫吸附实验（ELISA）法检测各组细胞内谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）水平。观察芦丁对细胞氧化应激指标的影响。
　　4．采用流式细胞学方法检测上述各组细胞的凋亡率，阶梯 DNA电泳法检测各组细胞DNA梯度的形成；DAPI核染色法观察各组细胞的核的形态变化。分别从形态学水平、分子水平对芦丁抑制人晶状体上皮细胞凋亡的作用进行评估。
　　5．运用 JC-1染色对各组细胞线粒体膜电位（ΔΨm）的变化进行检测，运用western-blot方法对各组细胞凋亡相关基因Bcl-2, Bax以及caspase-3的蛋白表达水平进行检测。以明确芦丁是否通过调控线粒体依赖的Bcl-2/Bax家族而发挥作用
　　6．将细胞分为4组，对照组，H2O2组，100μM芦丁组， PDTC(NFκB的抑制剂)组，运用免疫细胞化学法检测NFκB蛋白的激活和由胞浆向胞核内的转位，使用western-blot方法对各组中细胞核NFκB蛋白以及胞浆IκB蛋白表达量进行检测。以明确NFκB信号通道是否参与了芦丁对H2O2诱导的细胞凋亡的抑制作用
　　7．将细胞分为4组，对照组、H2O2组、100μM芦丁组、20μMPD98059组(ERK1/2的抑制剂)/10μMSB203580组(p38的抑制剂)/10μMSP600125组(JNK的抑制剂)，应用Western-blot方法检测MAPK信号通路中pERK、pp38、pJNK蛋白表达量的变化。以明确 MAPK信号通道是否参与了芦丁对 H2O2诱导的细胞凋亡的抑制作用。
　　结果：
　　1.与对照组相比，H2O2组细胞生存率、迁移率明显下降（P<0.05），与 H2O2组相比，不同浓度的芦丁组细胞生存率、迁移率明显提高（P<0.05）；与对照组相比，H2O2组形态异常的细胞数目明显增加，不同浓度的芦丁组中形态异常的细胞数目较 H2O2组明显减少；提示芦丁抑制 H2O2对细胞的损伤，提高细胞生存率，维持细胞形态的稳定。
　　2.与H2O2组相比，芦丁组细胞内ROS、MDA水平明显下降（P<0.05），SOD、GSH水平明显增加（P<0.05）。.芦丁抑制H2O2诱导的ROS的产生和脂质过氧化，保护细胞内的抗氧化系统。
　　3.流式细胞学的检查提示不同浓度的芦丁组细胞凋亡率较 H2O2组明显下降（P<0.01）。阶梯DNA电泳实验结果显示H2O2组中出现了典型的DNA阶梯，而在25μmol/L芦丁组仅有少量条带出现，50、100μmol/L芦丁组与对照组均无明显条带出现。DAPI核染色结果显示在 H2O2组中出现细胞核固缩、核崩解为脆片、轮廓不规则及偏位等形态学上的改变。在芦丁组中，细胞核形态上的改变明显较H2O2组减少。提示芦丁在形态学水平和分子水平都可以抑制 H2O2诱导的细胞凋亡，并且呈一定的剂量效应趋势。
　　4.不同浓度的芦丁组细胞ΔΨm较H2O2组明显上升（P<0.05），并且呈一定的剂量效应趋势。不同浓度的芦丁组在蛋白水平能够有效地抑制 H2O2诱导的 Bax, caspases-3的表达增加和Bcl-2表达减少（P<0.01）。提示芦丁可以保护ΔΨm的稳定，可能通过调控线粒体依赖的Bcl-2/Bax家族抑制晶状体上皮细胞的凋亡
　　5、免疫细胞化学分析结果显示在受到H2O2刺激后NF-кB蛋白由细胞质转移到细胞核，芦丁/PDTC可以明显抑制NF-кB的核转移。western blot结果显示：与对照组相比，H2O2组细胞核内NF-кB蛋白表达明显增加，细胞内总IкB蛋白表达明显降低（P<0.01），而芦丁或PDTC组可以抑制H2O2诱导的细胞核内NF-кB的蛋白表达的增加以及细胞总IкB的表达下降（P<0.01）。表明NF-кB信通道参与了芦丁抑制H2O2诱导的细胞凋亡。
　　6.Western blot结果发现：H2O2组中p-ERK、p-JNK和p-p38蛋白的表达量明显高于正常对照组，差异具有统计学意义（P<0.01），而在芦丁组和各条通道的抑制剂组中p-ERK、p-JNK和p-p38蛋白的表达低于H2O2组（P<0.01）。提示MAPK信号通道参与了芦丁对H2O2诱导的细胞凋亡的抑制作用。
　　结论：
　　芦丁抑制H2O2诱导的人晶状体上皮细胞的氧化损伤，主要与减少ROS的生成，减少脂质过氧化，保护细胞内抗氧化系统有关；芦丁抑制H2O2诱导的人晶状体上皮细胞的凋亡，主要与其保护ΔΨm的稳定，促进Bcl-2蛋白的表达，抑制Bax， caspase-3的蛋白表达有关；NF-кB和MAPK信号通路参与了芦丁抑制H2O2诱导的人晶状体上皮细胞凋亡。

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1 前 言

1.1研究背景

1.2 人晶状体上皮细胞（human lens epithelial cells, HLEC）

1.3 活性氧（reactive oxygen spiecies，ROS）与白内障

1.4 晶状体上皮细胞凋亡与白内障

1.5 调控细胞凋亡的相关信号通路

1.6 芦丁的药理作用

2、材料与方法

2.1材料

2.2实验方法

2.3统计学处理

3. 实验结果

3.1 不同浓度H2O2对 HLEC增殖的影响

3.2不同浓度芦丁对HLEC增殖的影响

3.3不同浓度芦丁对H2O2诱导的细胞生存率下降的影响

3.4不同浓度芦丁对H2O2诱导的细胞形态学变化的影响

3.5芦丁对H2O2诱导HLEC迁移速率下降的影响

3.6不同浓度芦丁对H2O2诱导的细胞凋亡的影响

3.7 芦丁抑制H2O2诱导的细胞内ROS的产生。

3.8芦丁抑制H2O2诱导的细胞内SOD,GSH的降低和MDA的升高

3.9 芦丁抑制H2O2诱导的线粒体膜电位（ΔΨm）的丢失

3.10 芦丁调节细胞内凋亡相关蛋白的表达

3.11芦丁阻止H2O2诱导的HLEC内NF-κB/p65的激活和移位

3.12 芦丁抑制H2O2诱导的HLEC内MAPK途径的激活

4讨论

4.1芦丁抑制H2O2对细胞的损伤，提高细胞生存率，维持细胞形态的稳定

4.2芦丁抑制H2O2诱导的ROS的产生和脂质过氧化，保护细胞内的抗氧化系统

4.3芦丁抑制H2O2诱导的细胞的凋亡

4.4芦丁可能通过调控线粒体依赖的Bcl-2/Bax家族抑制晶状体上皮细胞的凋亡。

4.5 NF-кB信通道参与了芦丁对H2O2诱导的细胞凋亡

4.6 MAPK信号通道参与了芦丁对H2O2诱导的细胞凋亡

5、结论

6、研究的不足对本课题的进一步设想

参考文献

附录

致谢

综述:氧化损伤、细胞凋亡与白内障