产KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌检测方法构建与耐药探索

摘要

背景：
　　碳青霉烯类抗生素被认为是治疗产超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum p-lactamases, ESBLs)和头孢菌素酶(AmpC酶)革兰阴性菌引起的重症多药耐药感染的首选药物。但随着该类药物的广泛使用，细菌对其耐药性也日益增加，可以用来有效治疗由碳青霉烯类抗生素耐药菌所致感染的抗生素极其有限，因此这类细菌所致的感染巳成为全球抗感染的重大问题。
　　细菌对碳青霉烯类抗生素产生耐药性的主要机制有AmpC酶或/和ESBLs高表达合并因外膜孔蛋白(outermembrane proteins, OMP)改变而导致的外膜通透性下降致碳青霉烯类抗生素作用靶位改变而对该类药物亲和力的下降，作用靶位主要为青霉素结合蛋白(penicilHnbinding proteins，PBPs)。水解碳青霉烯类抗生素的β-内酰胺酶(碳青霉烯酶)的产生外排系通改变导致药物外排的增加，其中产生碳青霉烯酶是鲍曼不动杆菌和肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗生素产生耐药性的最主要机制，铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素产生耐药性的机制比较复杂，通常是综合作用的结果。碳青霉烯酶主要类型有Ambler分子分类中的A、B和D类酶。A类酶常见于肠杆菌科细菌中，近年也在鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌中被报道；B类酶多见于铜绿假单胞菌和不动杆菌中，也可在肠杆菌科细菌中出现；D类酶常见于不动杆菌和铜绿假单胞菌。
　　肺炎克雷白杆菌型碳青霉烯酶(Klebsiella pneumoniae carbapenemase，KPC)是近年被报道最多的A类碳青霉烯酶，2001年首次在美国的一株肺炎克雷伯菌中被分离到。迄今已在全球27个国家和地区的13种细菌中发现了16种亚型的KPC酶，其中美国、哥伦比亚、以色列、中国、希腊、巴西、阿根廷、波兰和意大利为重度流行国家。肠杆菌科细菌是产KPC酶的主要细菌，主要的流行亚型为KPC-2和KPC-3，在我国绝大多数为KPC-2。在很短的几年内就在如此多的国家发现产KPC酶的细菌，甚至有十个国家和地区在同一年发现产KPC酶的细菌。而且很多国家首次发现的携带产KPC酶细菌的患者都无进出KPC酶流行地区的旅游史，也无和来自KPC酶流行地区人员的接触史。在美国、加拿大、哥伦比亚、阿根廷、巴西、意大利和波兰等国家最早被发现的携带产KPC酶细菌的患者均无出国史，在西班牙8名最早被发现携带KPC酶的患者无一例有出国史。在我国分离到产KPC酶细菌的患者大多也无和来自KPC酶流行区的人员的接触史。
　　有报道显示该产 KPC酶菌在院内感染和社区感染的病原菌方面占有重要比重，在人体中主要存在于呼吸道、泌尿生殖道以及肠道部位，可引起相应人体部位的感染，如呼吸道感染、泌尿道感染、脑膜炎、肠炎和近期所报道的化脓性肝脓肿等疾病。碳青霉烯类抗生素属于β-内酰胺类抗生素，因其具有较广的抗菌谱和较强的抗菌活性在临床上被广泛使用，研究表明在肠杆菌科细菌中肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素的耐药阳性检出率是最高的。KPC酶被发现存在于肠杆菌科的多个菌属当中，肺炎克雷伯菌致病的主要原因是因为产KPC酶。目前要检测出产KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌难度较大，当采用临床常规的药敏检测方法进行检测时常有漏检发生，从而导致其在医院内的感染情况加剧，因此要治疗该菌感染、抑制其传播的前提是能够做到正确、有效、及时地检测出产KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌。为此本研究对产KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的检测方法及耐药机制进行了探讨。
　　目的：
　　探讨产肺炎克雷伯型碳青霉烯酶(Klebsiella pneumoniae carbapenemase，KPC)肺炎克雷伯菌检测方法以及肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制、可能的治疗药物。
　　方法：
　　选取2014年1月～2014年12月安徽医科大学附属省立医院南区感染办收集、K-B法证实的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌36株纳入本研究，使用改良Hodge试验、Carba NP试验对菌株进行验证，随后采用PCR扩增、产物琼脂糖凝胶电泳实验，并对电泳阳性条带进行基因测序鉴定。
　　结果：
　　1. K-B法药敏试验发现36株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌，对碳青霉烯类耐药而对替加环素及米诺环素仍然敏感；
　　2.36株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌行改良Hodge确证试验有33株为阳性结果。
　　3.对Hodge试验阳性33株肺炎克雷伯菌再行Carba NP试验确证，其中27株阳性（87.9％，27/33），6株（12.1%，6/33）阴性；对Hodge试验阳性33株肺炎克雷伯菌行PCR扩增及电泳实验，共有27株出现目标条带(340bp)提示阳性，与Carba NP试验结果相一致；
　　4.对出现目标条带的27株肺炎克雷伯菌再进行KPC耐药基因PCR扩增产物测序，均为KPC-2型耐药基因。
　　结论：
　　1.初步建立产KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌检测方法，即K-B法进行药敏试验筛选，联合Carba NP试验确证，最后PCR测序证实产KPC类型。
　　2. K-B法药敏试验及改良Hodge试验均存在一定假阳性，存在可靠性问题，Carba NP试验可靠，PCR测序证实产KPC类型。
　　3.我院产KPC肺炎克雷伯菌的耐药机制均是产KPC-2。
　　4. K-B法进行药敏试验筛选发现替加环素仍然敏感，是否是治疗产KPC肺炎克雷伯菌的可能药物有待临床进一步观察。

目录

声明

中英文缩写对照表

1引言

2 材料与方法

2.1 标本来源

2.2 主要仪器

2.3主要试剂

2.4方法

2.5统计学处理

3 结果

3.1药敏试验结果

3.2 改良 Hodge试验、Carba NP 试验检测肺炎克雷伯菌结果

3.3 电泳图片及 KPC-2耐药基因PCR扩增产物测序图

3.4 不同方法检测结果比较

4.讨论

5.结论

参考文献

个人简介

致谢

综述:产 KPC KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的研究进展